RGD13肽抑制OPN誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞黏附與遷移.pdf

1、目的：血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）具有收縮型與合成型兩種表型。血管損傷時(shí)，血流動(dòng)力學(xué)發(fā)生改變及局部細(xì)胞因子釋放，管壁各層細(xì)胞成分發(fā)生變化，中膜VSMC由收縮型轉(zhuǎn)化為合成型，并大量增殖，導(dǎo)致管腔狹窄。骨橋蛋白（osteopontin，OPN）是一種分泌型的糖基化磷蛋白，是VSMC由收縮表型向合成表型轉(zhuǎn)化的標(biāo)志。OPN通過RGD序列與細(xì)胞表面的多種整合素受體，如αvβ3、αvβ5，αvβ

2、1等相互作用而調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附、遷移、增殖等多種生物學(xué)行為。而合成肽SVVYGLR已被證明在多種炎性反應(yīng)如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中起治療作用。因此，我室設(shè)計(jì)合成具有以上兩種黏附基序的13肽分子-GRGDSVVYGLRSK-，以此作為誘騙寡肽阻斷OPN與整合素的相互作用，觀察其在OPN誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞黏附與遷移中的抑制作用，并初步探討其機(jī)理。
　　 方法：通過黏附、遷移實(shí)驗(yàn)觀察RGD13肽對(duì)細(xì)胞黏附、遷移活性的抑制效應(yīng)；免疫熒光定位分析觀

3、察RGD對(duì)OPN誘導(dǎo)的VSMC黏著斑形成的影響；Western blot和免疫沉淀分析檢測(cè)RGD對(duì)OPN誘導(dǎo)的ILK去磷酸化的作用；RT-PCR、Western blot和酶圖分析檢測(cè)RGD對(duì)OPN誘導(dǎo)的MMP-2表達(dá)和活性的影響。
　　 結(jié)果：
　　 1 OPN和RGD對(duì)VSMC增殖活性的影響。
　　 MTT分析結(jié)果表明，不同濃度的OPN（20、40、80μg/mL）對(duì)VSMC增殖活性具有輕度的誘導(dǎo)作用，且呈劑

4、量依賴性。當(dāng)用不同濃度的RGD13肽預(yù)孵育后，則OPN誘導(dǎo)的VSMC增殖活性被抑制。10μg/mL的RGD13肽可完全消除OPN的促增殖效應(yīng)。
　　 2 RGD抑制OPN誘導(dǎo)的VSMC黏附。
　　 細(xì)胞黏附分析結(jié)果表明，OPN可劑量依賴性的提高VSMC的黏附活性，當(dāng)OPN濃度達(dá)到20μg/mL時(shí)VSMC黏附活性較對(duì)照組有明顯升高（P<0.05）。用RGD預(yù)孵育VSMC1 h后，VSMC在OPN包被孔板上的黏附受到抑制；R

5、GD對(duì)細(xì)胞粘附活性的抑制效應(yīng)具有劑量依賴性。結(jié)果提示，RGD可阻斷OPN誘導(dǎo)的VSMC黏附。
　　 3 RGD抑制OPN誘導(dǎo)的VSMC粘著斑形成。
　　 以整合素耦聯(lián)激酶（ILK）為標(biāo)志物，用免疫熒光分析觀察黏著斑的形成，結(jié)果顯示，未經(jīng)OPN處理的VSMC用ILK單克隆抗體進(jìn)行免疫熒光染色后，胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)散在點(diǎn)狀分布的細(xì)小熒光顆粒；細(xì)胞經(jīng)20μg/mL OPN孵育5、10、30、60 min后，胞質(zhì)內(nèi)的熒光顆粒逐漸增多、形

6、成束狀整齊排列的黏著斑輪廓；用RGD（5μg/mL）預(yù)孵育1 h后再經(jīng)OPN處理的VSMC，其胞質(zhì)內(nèi)熒光顆粒減少，熒光強(qiáng)度變?nèi)?，表明黏著斑形成受到抑制?br>　　 4 RGD抑制OPN誘導(dǎo)的ILK去磷酸化作用。
　　 已經(jīng)證實(shí)，在OPN促細(xì)胞黏附信號(hào)的跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)中，伴有ILK的脫磷酸化。免疫沉淀和Western印跡分析結(jié)果顯示，在靜止期細(xì)胞中ILK的蘇氨酸磷酸化水平較高，OPN刺激使其磷酸化程度下降，至30 min時(shí)降到最低，

7、與對(duì)照組比較，磷酸化的ILK降低55.4％。經(jīng)過RGD預(yù)孵育1h后，隨著RGD濃度的增高，OPN誘導(dǎo)的ILK去磷酸化作用被消除。提示RGD可阻斷OPN信號(hào)的跨膜傳導(dǎo)。
　　 5 RGD抑制OPN誘導(dǎo)的VSMC遷移。
　　 傷口愈合實(shí)驗(yàn)顯示，OPN可以提高VSMC的遷移活性。RGD預(yù)孵育后，OPN誘導(dǎo)的VSMC遷移被抑制；在所觀察的濃度范圍內(nèi)，10μg/mL RGD對(duì)OPN誘導(dǎo)的VSMC遷移的抑制作用最強(qiáng)。與對(duì)照組相比，R

8、GD使VSMC平面遷移和跨膜遷移活性分別降低57％和52％。由此，RGD對(duì)OPN誘導(dǎo)的VSMC遷移具有顯著的抑制作用。
　　 6 OPN誘導(dǎo)MMP-2表達(dá)和活性。
　　 基質(zhì)金屬蛋白酶-2（matrix metalloproteinases2，MMP-2）在VSMC遷移中發(fā)揮著重要的作用，為了闡明OPN誘導(dǎo)VSMC遷移是否與調(diào)節(jié)MMP-2活性有關(guān)，我們檢測(cè)了OPN對(duì)該基因表達(dá)的影響。Western blot和RT-PCR

9、結(jié)果顯示，OPN可以劑量依賴性和時(shí)間依賴性地誘導(dǎo)MMP-2的表達(dá)。酶圖分析顯示，在同樣條件下，MMP-2酶活性也平行升高。結(jié)果表明，OPN誘導(dǎo)VSMC的遷移與提高M(jìn)MP-2的表達(dá)和活性有關(guān)。
　　 7 RGD抑制OPN誘導(dǎo)的MMP-2表達(dá)和活性。
　　 Western blot和RT-PCR結(jié)果顯示，不同濃度的RGD預(yù)孵育VSMC1 h后，能夠消除OPN誘導(dǎo)的VSMC中MMP-2的表達(dá)。在所觀察的濃度范圍內(nèi)，10μg/m

10、L ROD對(duì)OPN誘導(dǎo)的MMP-2表達(dá)的抑制作用最強(qiáng)。與對(duì)照組相比，RGD預(yù)處理后，OPN誘導(dǎo)的MMP-2的mRNA和蛋白表達(dá)水平分別降低了68％和59％。此外，酶圖分析可見，RGD預(yù)孵育也明顯降低MMP-2水解明膠的活性。結(jié)果提示，RGD抑制OPN誘導(dǎo)的VSMC遷移活性與降低MMP-2的表達(dá)和活性相關(guān)。
　　 結(jié)論：
　　 1 RGD可以劑量依賴性抑制OPN誘導(dǎo)的VSMC黏附。
　　 2 RGD抑制OPN誘導(dǎo)的