牛赤羽病病毒重組N蛋白抗原間接ELISA診斷試劑盒的研制.pdf

1、為獲得赤羽病病毒(AkabaneVirus，AKAV)核衣殼(N)蛋白重組抗原作診斷應(yīng)用研究，經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增了OBE-1株的S節(jié)段，將其克隆到pMD18-T載體。用帶有酶切位點(diǎn)的引物從該重組載體亞克隆出表達(dá)核衣殼蛋白的N基因，用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切后與同樣處理的表達(dá)載體pET-28a(+)進(jìn)行連接，然后轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞。將篩選出的陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序、IPTG誘導(dǎo)表達(dá)、融合蛋白純化及活性鑒定。N基因ORF全長(zhǎng)702bp，編碼233氨

2、基酸，通過(guò)SDS-PAGE和Westernblotting檢測(cè)，證實(shí)重組菌株可高效表達(dá)有免疫學(xué)活性的分子量約27kD的可溶性融合蛋白，用薄層掃描儀分析其最高表達(dá)量可占可溶性菌體蛋白總量的58.5％。工程菌經(jīng)超聲波裂解高速離心后上清在天然狀態(tài)下用ProBondTMPurificationSystem(含Ni2+)純化，經(jīng)過(guò)對(duì)純化條件的優(yōu)化，融合蛋白純度可達(dá)99％。將純化的重組N蛋白免疫兔，獲得了重組N蛋白的抗血清。以此抗血清作一抗，利用間

3、接熒光抗體法在AKAV感染的BHK21培養(yǎng)細(xì)胞和攻毒的乳鼠腦組織中特異性地檢測(cè)到了AKAV抗原，這為赤羽病的病原學(xué)診斷提供了簡(jiǎn)便的檢測(cè)方法。以純化的重組N蛋白作為診斷抗原，研制了檢測(cè)牛血清特異性AKAVN蛋白抗體的間接ELISA診斷試劑盒。經(jīng)研究確定最佳抗原包被量為1μg/100μl/孔，樣品稀釋度為1：100，兔抗牛IgG辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記抗體稀釋度為1：8000。經(jīng)特異性試驗(yàn)和重復(fù)性試驗(yàn)證明該方法特異性高、重復(fù)性好。應(yīng)用研制的間接E