優(yōu)化配比率制備PEG化殼聚糖-DNA納米復合物并向大鼠主動脈平滑肌細胞轉(zhuǎn)染的研究.pdf

1、目的:制備PEG化的殼聚糖納米粒(PEG—CS NPs)作為載體，連接上載ACE—shRNA pGenesil質(zhì)粒，構(gòu)建PEG化的殼聚糖/DNA納米復合物(PEG—CS/DNA—NC)，研究其相關(guān)的生物學特性，并向大鼠主動脈平滑肌細胞(RASMC)轉(zhuǎn)染，觀察轉(zhuǎn)染前后細胞ACE mRNA表達的變化。 方法:1．制備PEG—CS NPs：采用離子交聯(lián)法制備殼聚糖納米粒(CS NPs)，并與PEG結(jié)合，通過噴金電鏡觀察其大小、形態(tài)及分

2、布。 2．構(gòu)建靶向抑制大鼠ACE基因的短發(fā)夾狀RNA(shRNA)真核表達載體：在GenBank上選取大鼠ACE mRNA序列，根據(jù)小干擾RNA(siRNA)設(shè)計原則，設(shè)計一條靶序列，并進行BLAST驗證。然后合成靶序列單鏈并退火形成雙鏈，與線性化pGenesil-1質(zhì)粒載體連接，進行酶切和測序鑒定。構(gòu)建的重組質(zhì)粒命名為pACE—shRNA。 3．殼聚糖/DNA納米復合物(CS/DNA—NC)及PEG—CS/DNA—NC

3、的構(gòu)建及相關(guān)生物學特性的研究：①CS NPs和PEG—CS NPs分別與質(zhì)粒DNA(pDNA，濃度：0.5ug/ul)以不同的體積比(單位：ul)結(jié)合，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析納米載體與pDNA的結(jié)合能力，通過紫外分光光度計檢測其包埋率；②噴金電鏡觀察CS/DNA—NC和PEG—CS/DNA—NC的大小、形態(tài)；③選擇以最佳配比率結(jié)合的PEG—CS/DNA—NC及等量的裸質(zhì)粒分別與不同濃度的DNaseⅠ相作用，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析納米載體對p

4、DNA的保護作用；④觀察PEG—CS/DNA—NC在不同pH值的PBS溶液中的釋放情況，通過紫外分光光度計檢測其釋放率。 4．PEG—CS/DNA—NC轉(zhuǎn)染RASMC條件的優(yōu)化：①采用貼塊法原代培養(yǎng)RASMC，倒置相差顯微鏡下觀察細胞生長狀態(tài)，通過α—肌動蛋白免疫熒光法對培養(yǎng)細胞進行鑒定，選用第3-4代細胞進行實驗。②選擇以最佳配比率結(jié)合的CS/DNA—NC及PEG—CS/DNA—NC60ul、80ul、100ul、120ul轉(zhuǎn)

5、染RASMC，用倒置熒光顯微鏡及流式細胞儀觀察和測定不同時間(24h、48h、72h)基因轉(zhuǎn)染效率，同時用MTT法檢測細胞存活率，尋求轉(zhuǎn)染效率較高且細胞毒性較低的最佳轉(zhuǎn)染條件。 5．質(zhì)粒pACE—shRNA抑制大鼠主動脈平滑肌細胞ACE表達的研究：用以最佳配比率結(jié)合的、最佳體積的PEG—CS/DNA—NC轉(zhuǎn)染大鼠RASMC，分別于轉(zhuǎn)染前及轉(zhuǎn)染后的24h、48h、72h收集細胞，用RT—PCR檢測ACEmRNA的表達。大鼠RASM

6、C分為三組：①空白對照組(細胞內(nèi)不加任何干擾因素)；②裸質(zhì)粒對照組(細胞轉(zhuǎn)染等量的裸質(zhì)粒)；③PEG—CS/DNA—NC組(細胞轉(zhuǎn)染PEG—CS/DNA—NC)。 結(jié)果:1．噴金電鏡結(jié)果顯示殼聚糖納米粒直徑約5nm，分布均勻，形態(tài)呈近似球形；與PEG結(jié)合后直徑、形態(tài)及分布均未發(fā)生明顯改變。 2．經(jīng)DNA測序和酶切鑒定，證明我們構(gòu)建的靶向抑制大鼠ACE基因的shRNA真核表達載體—重組質(zhì)粒pACE—shRNA無基因突變，符

7、合實驗要求。 3．①瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示CS NPs和PEG—CS NPs均能有效的結(jié)合pDNA，通過紫外分光光度計檢測出當CS NPs和PEG—CS NPs與pDNA比例為10：10時包埋率最高，分別為96.8％和98.7％。②噴金電鏡結(jié)果顯示CS/DNA—NC直徑約80nm，分布均勻，形態(tài)呈近似球形；PEG—CS/DNA—NC直徑約100nm，形態(tài)和分布均為發(fā)生明顯改變。③隨著DNaseⅠ濃度的增加，裸質(zhì)粒被不同程度的降解

8、，當DNaseⅠ濃度達到0.1u時，裸質(zhì)粒被完全降解，而PEG—CS NPs能抵抗其降解，pDNA被完全阻滯于加樣孔中。④在pH值為3.5-7.5的PBS溶液中釋放的情況基本相同，均存在開始階段的爆破釋放，釋放曲線前段接近直線，約50小時后，釋放量開始穩(wěn)定，釋放曲線緩慢上升，平穩(wěn)維持釋放100小時左右。而在pH值為9.0的PBS溶液中快速釋放，只釋放了50小時左右。 4．①在倒置相差顯微鏡下觀察，細胞呈典型的“峰—谷狀”樣生長。

9、熒光顯微鏡下可見細胞胞漿內(nèi)均呈現(xiàn)綠色熒光，即胞漿內(nèi)表達α—肌動蛋白，符合平滑肌細胞特征。②根據(jù)轉(zhuǎn)染效率以及細胞生存率的測定，篩選出以最佳配比率(10：10)結(jié)合的PEG—CS/DNA—NC為100ul時轉(zhuǎn)染效率為55.2％，細胞生存率72h為90.3％，優(yōu)于其他條件時的轉(zhuǎn)染效率，故作為我們進一步實驗的最佳選擇。 5．PEG—CS/DNA—NC100ul在轉(zhuǎn)染后48h平滑肌細胞內(nèi)ACEmRNA的表達明顯降低，與空白對照組和裸質(zhì)粒組

10、比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，72h時表達更低(P＜0.05)。 結(jié)論:1．成功制備出呈近似球形、分布均勻的PEG—CS NPs。 2．成功構(gòu)建了以大鼠ACE基因為靶位的真核表達載體pACE—shRNA。 3．PEG—CS NPs能有效的結(jié)合pDNA，并保護其免受DNaseⅠ的降解；CS/DNA—NC直徑約80nm，PEG—CS/DNA—NC直徑約100nm，均符合轉(zhuǎn)染要求；PEG—CS/DNA—NC在p