雞精液稀釋液設(shè)計與篩選方法學(xué)研究.pdf

1、迄今為止，國內(nèi)外雖有不少有關(guān)雞精液稀釋液研究的相關(guān)報道，但關(guān)于精液稀釋液設(shè)計與篩選方法學(xué)的研究尚屬缺乏。在這一領(lǐng)域沒有一套完整而實用的理論體系，對諸如精液稀釋液pH、滲透壓、緩沖能力和配方物質(zhì)組成進行調(diào)控、篩選和評價，如緩沖能力就沒有具體參數(shù)可供借鑒，也缺乏測定方法等。有鑒于此，本論文擬從方法學(xué)的角度，探索雞精液稀釋液設(shè)計與篩選方面的指標(biāo)體系和測定方法，用以指導(dǎo)制備高受精率的雞精液稀釋液，以適應(yīng)現(xiàn)代養(yǎng)雞生產(chǎn)的需要。 本論文包括三

2、個部分，第一部分是雞精液稀釋液設(shè)計與主要液體質(zhì)量指標(biāo)的確定、控制與測定研究。對精液稀釋液pH、滲透壓和緩沖能力梯度進行理論控制，然后以實際測定結(jié)果檢驗控制的準(zhǔn)確性。第二部分是雞精液稀釋液實驗室篩選研究——稀釋精液體外精子生存質(zhì)量與形態(tài)學(xué)觀察研究。通過研究不同pH、滲透壓、緩沖能力和溶質(zhì)種類的稀釋液以及保存時間和溫度對保存于其中的精子形態(tài)和機能的影響，確定最佳稀釋液的合理參數(shù)。第三部分是雞稀釋精液人工授精應(yīng)用研究，以稀釋精液進行人工授精，

3、以受精率對稀釋液及其設(shè)計和篩選方法的優(yōu)劣做出客觀的評價。 實驗結(jié)果表明：①pH的理論控制準(zhǔn)確率在98.69﹪，滲透壓準(zhǔn)確率在95.9﹪-99.1﹪，緩沖指數(shù)準(zhǔn)確率在97.6﹪以上。 ②在2℃-5℃低溫條件下，稀釋液緩沖指數(shù)不影響精子活率，但影響精子畸形率。緩沖指數(shù)348時，精子畸形率極顯著地低于緩沖指數(shù)119.6～228.8和461.6～1147.6范圍的畸形率。為了保持精子正常的形態(tài)，不但要求要有合適的pH和滲透壓，同

4、時還要求有適中的緩沖指數(shù)。稀釋液緩沖指數(shù)對精子畸形率的影響較精子活率的影響大。 ③檸檬酸鈉、葡萄糖對雞精液的保存，具有重要作用，而氯化鉀在雞精液稀釋液中并不是必需的；復(fù)方稀釋液保存效果普遍優(yōu)于單方稀釋液；低溫下雞精液稀釋液滲透壓應(yīng)為等滲或接近等滲，且最適滲透壓還與構(gòu)成稀釋液的物質(zhì)種類和相互配比有關(guān)系；稀釋液PH應(yīng)接近中性，最好與精液pH保持一致；在緩沖指數(shù)為3.894-7.257的范圍內(nèi)，緩沖指數(shù)與精子保存效果的兩個指標(biāo)均呈現(xiàn)顯

5、著的負(fù)相關(guān)關(guān)系。 ④精子最高生存指數(shù)出現(xiàn)在三種有機鹽的稀釋液中；兩種無機鹽液中精子存活時間最長，但精子畸形率很高；滲透壓值與精子頭部畸形類型高度相關(guān)(p＜0.01)，與精子頭部彎曲且膨脹百分?jǐn)?shù)的相關(guān)系數(shù)為-0.93，與精子頭部單純彎曲百分?jǐn)?shù)的相關(guān)系數(shù)為0.94。在300mmol/L時，精子生存指數(shù)、存活時間均較好；500mmol/L時精子畸形率最低；滲透壓對保存效果有極顯著的影響，物質(zhì)種類對保存48h精子形態(tài)有顯著地影響，且滲透

6、壓與精子畸形類型有一定關(guān)系。 ⑤無機鹽氯化鈉、氯化鉀在350mmol/L滲透壓濃度單獨使用時可以獲得較高的精子存活時間和精子生存指數(shù)，但不利于維持雞精子細胞膜的完整性。有機鹽檸檬酸鈉、檸檬酸鉀在350mmol/L滲透壓濃度時精子存活時間和生存指數(shù)比400mmol/L滲透壓濃度時要低，可知最佳的滲透壓濃度在350mmol/L-400mmol/L之間。谷氨酸鈉在250mmol/L滲透壓濃度時，精子存活時間、精子生存指數(shù)和精子形態(tài)完整

7、率均較好，其最佳滲透壓不是等滲，而是偏低滲。在本實驗條件下這三中有機鹽液對雞精子形態(tài)有穩(wěn)定和保護作用。葡萄糖、蔗糖、果糖單成分液均有穩(wěn)定或保護雞精子形態(tài)完整的良好作用；葡萄糖的最適滲透壓濃度接近250mmol/L，蔗糖的在200mmol/L-250mmol/L之間。氯化鈉和氯化鉀以5∶1比例制成350mmol/L滲透壓濃度時可以獲得比單獨使用時更高的精子存活時間和生存指數(shù)，但不能改變無機鹽對雞精子細胞膜的破壞作用。250mmol/L谷氨

8、酸鈉和450mmol/L的果糖以1∶2組合后可以獲得較為理想的雞精子機能和形態(tài)保存效果。 ⑥由果糖、谷氨酸鈉、檸檬酸鉀和硫酸鎂四種物質(zhì)組成的7液最好，其pH為6.7，滲透壓為360mmol/L，緩沖指數(shù)為382，精子存活時間264h，活率大于0.6的存活時間148h，生存指數(shù)133。另外3液、4液、8液和9液保存效果亦較好，表明在pH6.7-7.2，滲透壓278mmol/L-434mol/L，緩沖指數(shù)280-582的范圍內(nèi)，對精

9、子的生存較為適宜。這一結(jié)果與在37℃下保存試驗的結(jié)果基本一致。 ⑦通過37℃下對雞精液進行稀釋保存效果的觀察，發(fā)現(xiàn)保存效果最好的是6-3和6-4液，其精子存活時間分別為9.9±1.55h，9.4±1.56h，生存指數(shù)分別為3.76±1.22，3.50±1.31，與其它幾個稀釋相比，差異極顯著(p＜0.01)。從而證明：適宜精子37℃下存活的pH范圍是6.7～7.75，滲透壓為335mmol/L-395mmol/L，緩沖指數(shù)為35

10、0。同時，結(jié)果表明，只有稀釋液的pH，滲透壓和緩沖指數(shù)均合適時，保存效果才會好。 ⑧雞精子在滲透壓為738、703mmol/L的1＃、2＃液中不能生存；在390、290和145mmol/L的6＃、7＃、8＃液中，存活時間依次為9.8±1.66h、9.1±1.43h、8.9±1.45h，生存指數(shù)依次為3.7±1.14、3.3±1.28、3.2±1.32極顯著地長或高于3＃、4＃液的2.4±0.78h、3.2±0.81h和0.12±

11、0.07、0.58±0.11(P＜0.01)，顯著地長或高于5＃液的6.5±1.21h和1.3±0.42(P＜0.05)。表明適于精子生存的滲透壓以等滲為宜，但同時受配方物質(zhì)成分的影響。 ⑨稀釋液溶劑是影響稀釋保存效果的重要因素，以注射用水制備的3液精子存活時間和生存指數(shù)分別為134.5h、48.58，顯著地優(yōu)于以蒸餾水制備的稀釋液。在葡萄糖-磷酸鹽稀釋液中，添加谷氨酸鈉比添加檸檬酸鈉保存效果好，精子存活時間和生存指數(shù)分別提高2

12、2﹪、33.5﹪。另外，在3℃保存雞精液時，稀釋液等滲條件比添加能源物質(zhì)如葡萄糖更重要。 ⑩通過對4個精液稀釋液的pH、滲透壓、緩沖指數(shù)、3℃-5℃下精子存活時間與生存指數(shù)的測定，并在生產(chǎn)條件下用這4個稀釋液進行人工授精試驗表明：雞精液稀釋液pH、滲透壓、緩沖指數(shù)是影響精子存活時間、生存指數(shù)和受精率的重要因子。pH為7.0，滲透壓為330mmol/L，緩沖指數(shù)為461的1號液，精子存活時間為254±33h，生存指數(shù)為95±22，

13、受精率為96.4﹪，極顯著地高于原精對照組和另外3個稀釋液。 通過以上實驗結(jié)果可以得出以下結(jié)論：通過本文建立的計算和實測方法預(yù)先對精液稀釋液的pH、滲透壓和緩沖能力三項液體指標(biāo)進行控制，能夠準(zhǔn)確地設(shè)定待配精液稀釋液的物理指標(biāo)，為精液稀釋液的實驗室篩選奠定良好基礎(chǔ)；采用精子機能指標(biāo)(精子總存活時間、精子生存指數(shù))和精子形態(tài)學(xué)指標(biāo)(精子形態(tài)完整率或精子畸形率)相結(jié)合的評價指標(biāo)體系，在實驗室低溫(1℃-5℃)和高溫(37℃)下進行稀釋