Th17細胞-白介素-17在病毒性心臟病中的作用及機制研究.pdf

1、病毒性心肌炎(viral myocarditis，VMC)是由各種病毒感染引起的以心肌局灶性或彌漫性壞死為特征，伴隨心肌間質(zhì)的非特異性急、慢性炎癥反應、纖維化或心臟擴張等臨床表現(xiàn)的常見疾病。VMC好發(fā)于青壯年，其發(fā)病有逐年升高的趨勢。絕大多數(shù)VMC可以自愈，但是15～25％VMC患者可演變?yōu)閿U張型心肌病(dilated cardiomyopathy，DCM)，最終導致心力衰竭或惡性心律失常，其預后不良，病死率較高。Rose根據(jù)不同類型免

2、疫細胞浸潤將心肌炎分為淋巴細胞性心肌炎、巨細胞性心肌炎、嗜酸粒細胞性心肌炎和DCM等類型，同時國內(nèi)外學者將VMC分為病毒復制期、免疫反應期和DCM期。因此，免疫損傷機制在VMC中起著重要的作用。既往研究認為，病毒感染機體后，急性期大量病毒在宿主心肌細胞中復制，直接導致心肌細胞的損傷、壞死及凋亡。而在急性期后若病毒未被機體清除，一方面病毒在心肌細胞中持續(xù)低水平復制，可以繼續(xù)直接損傷心肌結構及功能；另一方面也可通過激活并維持免疫反應而導致心

3、肌進一步損傷。因此本研究主要從VMC發(fā)生、發(fā)展及演變過程中可能存在的免疫機制為線索，探索細胞免疫在VMC發(fā)生、發(fā)展中的作用機制，為VMC的早期臨床診斷及探尋免疫治療的新靶點提供理論依據(jù)。
　　 在經(jīng)典的輔助性CD4+T淋巴細胞亞群Th1/Th2的研究過程中，發(fā)現(xiàn)了一種新型的Th17細胞亞群，其分化發(fā)育和功能特征明顯不同于之前發(fā)現(xiàn)的輔助性T淋巴細胞亞群Th1和Th2。Th17細胞的分化發(fā)育依賴于局部微環(huán)境及特定細胞因子的作用，其主

4、要分泌的效應分子為IL-17A/F、IL-22和IL-21。最初的研究認為，VMC機體中CD4+T細胞向Th1分化增加，分泌IFN-γ以降低病毒的復制，從而減少心肌免疫細胞的浸潤及炎癥刺激，并導致心肌纖維化的程度減輕，保護心肌細胞避免過度免疫損傷并降低心肌纖維化的程度。此外，有研究表明心肌炎的病理損傷與Th2型細胞免疫反應密切相關。目前研究認為，Th17與機體抗病原體感染及一些自身免疫病密切相關，即Th17細胞可誘導機體局部組織的炎癥反

5、應的發(fā)生、放大和級聯(lián)反應，繼而加重其病理類型的發(fā)生與發(fā)展。近年來，Th17細胞在自身免疫性心肌炎中的作用已成為心血管疾病研究的熱點，在實驗性自身免疫性心肌炎中的研究也取得了一定的進展。而VMC與實驗性自身免疫性心肌炎在病理類型、臨床表現(xiàn)、轉歸及預后上具有相同之處。那么，Th17細胞在機體受到病毒感染后的作用如何?當柯薩奇病毒感染后心肌局部炎癥發(fā)生、發(fā)展及演變中的作用機制如何?同時Treg細胞亞群具有免疫抑制功能的CD4+T細胞亞群，在免

6、疫炎癥性疾病中具有保護作用。Treg和Th17均起源于CD4+T細胞亞群，在特定地局部免疫微環(huán)境作用下，二者可以相互轉化、相互制衡。Th17/Treg細胞亞群失衡在多種自身免疫性疾病中受到了廣泛地關注，那么，VMC與其它類型的自身免疫性疾病一樣也存在Th17/Treg失衡現(xiàn)象?國內(nèi)外學者尚缺乏深入地闡述和研究。
　　 在病毒性心肌炎向擴張型心肌病的演變過程中，心肌炎癥是病毒感染導致心肌纖維化、心室重構和心力衰竭的共同通路，而心肌

7、炎癥反應主要依賴于不同類型的免疫細胞浸潤，形成不同的局部免疫微環(huán)境。目前在不同T淋巴細胞亞群在VMC中的作用及其機制研究甚少，特別是Th17細胞在VMC細胞外基質(zhì)的合成、分解和基質(zhì)金屬蛋白酶系統(tǒng)中作用的研究更少。因此，本研究通過探索Th17細胞在心肌組織局部微環(huán)境對心肌ECM的合成與分解和基質(zhì)金屬蛋白酶系統(tǒng)免疫調(diào)節(jié)中的作用機制，有利于尋找VMC的免疫診斷與治療的新途徑。
　　 柯薩奇B3病毒感染的小鼠在不同時期的心肌標本中有多種

8、免疫細胞浸潤，其中以大量巨噬細胞、中性粒細胞和淋巴細胞為主，伴隨少量的B細胞、樹突狀細胞(dendritic cells，DC)和自然殺傷細胞。其中DC作為抗原提呈細胞，可以捕獲提呈抗原，并逐漸演變?yōu)槌墒斓腄C，在體內(nèi)遷移，最終激活免疫反應。那么，DC在VMC的病因中的作用尚未清楚，但是DC從外周組織沿傳入淋巴管遷移至鄰近的次級淋巴組織后，與抗原特異性的初始T淋巴細胞聚集，誘導其活化并增殖，使其分化為效應性T細胞，從而啟動機體的一系列免

9、疫應答。隨著新型免疫細胞亞群的發(fā)現(xiàn)及Th17/Treg調(diào)節(jié)機制的不斷深入研究，DC在病毒性心臟病的發(fā)病機制也受到廣泛地重視。因此，DC在VMC的發(fā)生、發(fā)展、演變及轉歸等方面的作用，特別是在病毒性心臟病中Th17/Treg細胞亞群分化的作用機制等方面，值得我們進一步研究與探索。
　　 本研究致力于探討Th17細胞在急性病毒性心肌炎中的作用機制，特別是與其它細胞亞群的關系，如Treg細胞亞群；闡述Th17細胞在病毒性心肌炎向心肌纖維

10、化演變過程中的作用機制，并探索DC在病毒性心臟病中Th17/Treg細胞亞群分化中的調(diào)節(jié)作用，以尋求臨床上有效的免疫治療靶點。全文共分為以下四部分：
　　 第一部分 CVB3致小鼠病毒性心肌炎、擴張型心肌病模型的建立
　　 目的:建立小鼠急、慢性心肌炎和擴張型心肌病動物模型。
　　 方法:雄性Balb/c小鼠210只，體重12～16g，隨機設立病毒感染后不同時間點，分別為0天組(n=35)、7天組(n=35)、1

11、0天組(n=35)、14天組(n=35)、2月組(n=35)和3月組(n=35)。每組隨機抽取10只，腹腔注射不含病毒的Eagel's培養(yǎng)液(EMEM)，作為正常對照組(Control group)；其余小鼠腹腔均接種柯薩奇病毒B3(CVB3)建立小鼠急、慢性心肌炎和擴張型心肌病動物模型；分別于接種病毒后第0、7、10與14天及2月、3月末處死動物并收集外周血、血清、脾臟及心臟組織等標本；于感染后第7天、2月、3月末動物模型組與同期對照

12、組小鼠分別進行心臟超聲檢查、病理學染色并計算心肌膠原容積積分。
　　 結果:小鼠心肌在感染后第7天出現(xiàn)心肌纖維斷裂、心肌細胞變性壞死、間質(zhì)充滿炎性細胞浸潤，伴心肌纖維化增生，主要以局限在心肌壞死灶周邊；計算心肌病理積分結果顯示，在感染后第7天明顯升高，第10天最高，第14天后開始下降。而CVB3復制水平在感染后第7天最高。至第2月末感染小鼠出現(xiàn)心肌纖維斷裂，心肌內(nèi)炎性細胞浸潤，心肌間質(zhì)纖維化增加，心腔擴大及心臟收縮及舒張功能均減

13、退；第3月末小鼠心肌間質(zhì)大量膠原異常增生呈彌漫性分布，心肌炎性細胞浸潤減少，左室腔明顯擴大，心臟舒張功能顯著減退；同時心肌膠原容積積分明顯升高。
　　 結論:以CVB3單次和增量重復感染Balb/c小鼠成功建立了急、慢性病毒性心肌炎和擴張型心肌病動物模型。在急性病毒性心肌炎中，以感染后第7～10天心肌病理損傷最為明顯，CVB3病毒復制水平在第7天最高。在慢性病毒性心肌炎及擴張型心肌病中，以感染后第2個月后心臟結構與功能顯著減退，

14、但心肌膠原容積積分以第3個月最為顯著。
　　 第二部分 Th17細胞在急性病毒性心肌炎中的作用機制及對Treg細胞的影響
　　 目的:探討Th17細胞/白介素-17在急性病毒性心肌炎中的作用機制及其對Treg細胞亞群的影響。
　　 方法:首先采用流式細胞儀技術分別檢測正常對照組、急性病毒性心肌炎組(0、7、10、14天)脾臟中Th17細胞的表達，同時使用Real-time PCR技術檢測急性心肌炎心肌組織中CVB

15、3病毒復制水平與IL-17、TGF-β表達并進行相關性分析。采用激光共聚焦顯微鏡及酶聯(lián)免疫吸附試驗方法分別觀察Th17、Treg細胞在心肌組織及外周血清中IL-17、TGF-β的表達水平。分別對各組小鼠心肌組織進行HE染色計算心肌損傷的病理積分，使用Real-time PCR檢測病毒復制水平。再將Balb/c小鼠70只，隨機分為對照組(Control)(n=10)、急性心肌炎組(AVMC)(n=20)、Isotype組(n=20)及An

16、ti-IL-17組(n=20)。Control組小鼠腹腔注射等量EMEM；而AVMC、Isotype及Anti-IL-17A組小鼠均腹腔接種CVB3；然后Isotype及Anti-IL-17組小鼠于病毒感染后隔日分別腹腔注射IgG(100μg)、IL-17Ab(100μg)。所有小鼠均于病毒感染第7天后處死并取心臟組織、血清及脾臟組織；采用流式細胞儀測定CD4+，CD8+，CD4+/CD8+T淋巴細胞數(shù)量，并檢測CD4+Perforin

17、+T淋巴細胞，CD8+Perforin+T淋巴細胞，CD4+CD25+Foxp3+T淋巴細胞的表達量。使用Real-time PCR檢測心肌組織中IL-17A及CVB3病毒復制水平，并使用H&E染色計算心肌病理積分觀察各組心肌損傷的程度，最后采用Western blot法檢測心肌組織中IFN-γ、TGF-β1及VP1等蛋白表達水平，Cytomix方法檢測血清中T細胞亞群相關細胞因子的表達譜。
　　 結果:急性病毒性心肌炎感染后第

18、7、10及14天脾臟中Th17細胞數(shù)較正常對照組明顯增加，其中以第10天增加最為明顯，Real-time PCR實驗結果顯示心肌組織中IL-17A mRNA及CVB3 RNA水平表達均升高，二者呈顯著正相關關系。而心肌組織中TGF-β mRNA在心肌中的表達也呈明顯升高趨勢，但是與CVB3RNA水平呈顯著負相關關系；結合Western-blot及Cytomix方法檢測心肌組織及血清中Th17相關細胞因子IL-17A，IL-6，IL-21

19、，IL-10，IFN-γ和IL-2的表達水平，與正常對照組相比，這些細胞因子的表達均明顯升高。在急性病毒性心肌炎模型中，心肌組織H&E染色計算病理積分結果顯示，感染后第10天心肌損傷最重，而CVB3病毒復制在第7天最明顯。采用IL-17A中和抗體干預后，結果顯示IL-17A能夠改善急性病毒性心肌炎心肌病理損傷程度，并能夠降低心肌CVB3病毒復制水平；結合流式細胞技術及Western blot檢測結果顯示，IL-17A中和抗體干預能夠顯著

20、降低Treg細胞、提高體內(nèi)CD8+T細胞的數(shù)量及穿孔素的表達水平，使Treg細胞導致殺傷性T細胞的抑制功能恢復；同時上調(diào)心肌組織中IFN-γ的表達。從血清學的檢測結果也顯示，IL-17A中和抗體干預使體內(nèi)Th17細胞相關的細胞因子IL-6、IL-17A及IL-22的表達明顯下降，而IFN-γ的表達卻明顯升高。
　　 結論:急性病毒性心肌炎模型中小鼠脾臟Th17細胞及心肌中IL-17A表達與正常對照組比較明顯增加。同時在急性心肌炎

21、心肌組織中IL-17A mRNA的水平與CVB3病毒復制水平升高，二者呈正相關關系；而TGF-β mRNA在心肌中的表達也呈上升趨勢，但是與CVB3復制水平呈負相關關系。其中在感染后第10天Th17細胞表達最多，而CVB3病毒復制水平在第7天最高。IL-17A中和抗體明顯改善急性病毒性心肌炎的病毒復制水平及心肌病理損傷程度，這一過程的作用機制可能是通過IL-17中和抗體減輕Treg細胞過度抑制殺傷性T細胞效應及促進IFN-γ的表達增加有

22、關。
　　 第三部分：Th17細胞/IL-17在心肌炎向心肌纖維化演變中的作用及機制研究
　　 目的:研究阻斷IL-17R干預IL-17后，對急性心肌炎后向心肌纖維化演變過程中的作用及機制研究。
　　 方法:體內(nèi)試驗：將Balb/c小鼠50只，隨機分為3組，即慢性病毒性心肌炎組(n=10)，慢性病毒性心肌炎+AdIL-17R：Fc組(n=20)，慢性病毒性心肌炎+Ad：null組(n=20)。慢性病毒性心肌炎+A

23、dIL-17R：Fc組及慢性病毒性心肌炎+Ad：null組給予腹腔接種CVB3后，分別給予Ad：IL-17R：Fc及等量Ad：Fc；觀察各組小鼠死亡率，并在3個月末進行心超檢查后處死小鼠，采用天狼猩紅染色及免疫組織化學方法檢測心肌內(nèi)膠原含量并運用圖像分析軟件計算CVF和Ⅰ型、Ⅲ型膠原含量；使用ELISA方法測定血清中IL-6及TNF-α的含量，采用Western blot檢測小鼠心肌組織中TGF-β1、IL-17A、ADAMTS-1及M

24、MP-2/TIMP-1的表達水平，同時采用Real-time PCR方法檢測Ⅰ型和Ⅲ型膠原mRNA表達水平。
　　 體外試驗：使用不同濃度IL-17A細胞因子作用于體外培養(yǎng)的心肌成纖維細胞，了解其對細胞增殖及心臟細胞外基質(zhì)中重要的金屬蛋白酶ADAMTS-1及MMPs/TIMPs表達的影響，同時測定心肌成纖維細胞中Ⅰ型和Ⅲ型膠原mRNA水平變化，最后使用Real-time PCR方法觀察IL-17A對心肌成纖維細胞中ADAMTS-

25、1的作用是否通過ERK、p38、JNK MAPK的磷酸化修飾來實現(xiàn)的。
　　 結果:使用流式細胞儀方法檢測病毒感染后第2月、3月不同時間段Th17細胞的表達量。結果發(fā)現(xiàn)：與對照組比較，Th17細胞在第2月上升最為明顯；采用AdIL-17R：Fc干預后，我們發(fā)現(xiàn)明顯提高了小鼠的生存率(44％ VS20％，p<0.05)；降低慢性心肌炎小鼠血清中IL-6和TNF-α細胞因子的水平；同時降低小鼠心肌組織中IL-17A的表達，而對IL-

26、17RA的表達無明顯影響。通過流式細胞儀技術檢測外周Th17細胞，結果發(fā)現(xiàn)AdIL-17R：Fc能夠降低外周脾臟中Th17細胞(7.88±1.01％ VS10.3±1.67％，p<0.05)的表達。從心臟功能及形態(tài)學結果上發(fā)現(xiàn)，AdIL-17R：Fc能夠改善心功能并減輕心臟過度擴大，明顯降低心臟/體重比值。從心肌組織病理學檢測結果表明：AdIL-17R：Fc顯著降低心肌組織中CVF(4.27VS8.7，p<0.05)及Ⅰ型、Ⅲ型膠原在心

27、肌組織中的沉積。經(jīng)過蛋白印跡定量檢測結果發(fā)現(xiàn)：AdIL-17R：Fc能抑制心肌ADAMTS-1和MMP-2蛋白的表達，而對TIMP-1的表達無明顯影響；體外實驗研究結果顯示：IL-17A細胞因子能促進ADAMTS-1、MMP-2及TIMP-1的蛋白表達，并刺激心肌成纖維細胞Ⅰ型、Ⅲ型膠原的表達增加；同時促進心肌成纖維細胞的增殖。進一步通過體外實驗進一步探索IL-17A對心肌成纖維細胞ADAMTS-1作用的信號轉導途徑，結果顯示：IL-1

28、7A通過p38及ERK磷酸化途徑影響ADAMTS-1 mRNA水平的表達；而不是通過JNK的磷酸化途徑來實現(xiàn)的。
　　 結論:在慢性病毒性心肌炎及擴張型心肌病中，脾臟Th17細胞及心肌中IL-17A表達與正常對照組比較明顯增加，而在感染后第2月Th17細胞數(shù)量較同期對照組明顯上升，而感染后第3月有所下降。同時第2～3月心肌損傷及纖維化程度較同期對照組明顯增加，并且在感染后第3月的增加更為明顯。AdIL-17R：Fc干預后結果顯示

29、：AdIL-17R：Fc能降低擴張型心肌病小鼠死亡率及減輕心肌纖維化的機制，可能與其抑制Th17細胞及其分泌的IL-17A細胞因子后產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)作用有關。同時AdIL-17R：Fc使心肌組織中ADAMTS-1、MMP-2/TIMP-1表達明顯下降，減輕其對心肌細胞外基質(zhì)的降解作用，從而減少心肌細胞外基質(zhì)的破壞及降低心肌纖維化。另外在體外實驗也證明，IL-17A在心肌成纖維細胞中對ADAMTS-1作用的信號轉導通路與p38及ERK MAP

30、K磷酸化密切相關，驗證了體內(nèi)實驗中AdIL-17R：Fc可能導致IL-17A的產(chǎn)生，進一步降低細胞外基質(zhì)的破壞，從而產(chǎn)生抗纖維化的保護作用。
　　 第四部分 DC在急性病毒性心肌炎中的作用機制及其對T細胞分化為Th17、Treg細胞亞群的影響
　　 目的:探討DC在急性病毒性心肌炎中的作用機制及其對T細胞向Th17、Treg細胞亞群分化的影響。
　　 方法:通過采集正常對照組(n=15)、急性病毒性心肌炎組(n=

31、15)小鼠骨髓來源的DC進行原代培養(yǎng)，并對成熟的DC進行影像學及流式細胞儀鑒定DC表面分子標記物的表達。提取正常對照組小鼠外周脾臟組織CD4+T細胞，并使用磁珠分選后CD4+T細胞，重懸于RPMI-1640培養(yǎng)液，待與DC細胞共培養(yǎng)使用。然后采集正常對照組及急性病毒性心肌炎組小鼠骨髓來源的DC，并使用磁珠分選兩組來源的DC后，與分選后CD4+T細胞共培養(yǎng)，并將不同組T淋巴細胞進行體外定向Th17及Treg細胞亞群分化。采用流式細胞技術及

32、ELISA方法檢測Th17、Treg細胞的數(shù)量及上清夜中IL-17A和TGF-β的含量，并使用細胞增殖實驗(CCK-8)了解負載病毒抗原DC對CD4+T細胞增殖的影響。
　　 結果:首先在小鼠骨髓來源的DC原代培養(yǎng)后觀察，DC早期呈現(xiàn)貼壁生長方式，第2～3天后呈現(xiàn)多處集落生長，并且可見出芽狀的突起，5～7天后集落漸漸減少，突起變長，呈懸浮生長方式，即從未成熟狀態(tài)轉化為成熟狀態(tài)的DC。采用流式細胞技術對急性病毒性心肌炎骨髓來源的D

33、C表面分子標志物檢測，結果顯示CD40、CD80和MHC-Ⅱ的表達比正常對照組明顯增加，而CD86表面分子在二者之間未見顯著性差異。在小鼠外周脾臟組織提取CD4+T細胞，使用磁珠分選的后CD4+T、DC細胞的純度分別達到92％和95％，然后將來源于不同組別提取的DC向Th17和Treg細胞定向分化培養(yǎng)，結果顯示：負載病毒抗原的DC能夠刺激CD4+T淋巴細胞的增殖增加；同時促進CD4+T細胞向Th17細胞亞群分化增加，與對照組相比，有顯著

34、統(tǒng)計學意義；而二者在向Treg細胞亞群分化中，無顯著統(tǒng)計學意義。
　　 結論:急性病毒性心肌炎模型中骨髓來源的DC的成熟度與正常對照組比較明顯增加。同時采用體外共培養(yǎng)及定向分化實驗，結果表明：柯薩奇病毒感染機體后，能促進CD4+T細胞的增殖，并且促使初始T淋巴細胞向Th17細胞分化增加，而向Treg細胞亞群分化不明顯。因此，在急性病毒性心肌炎模型中，Th17細胞亞群的增加可能與負載病毒抗原DC的遞呈作用有關，而這種作用可能是促使