CDK2在皰疹病毒復(fù)制中作用的研究.pdf

1、皰疹病毒宿主廣泛,引起人和許多動(dòng)物多種多樣的感染。除急性感染外,還有潛伏感染和反復(fù)發(fā)作的傾向。皰疹病毒復(fù)制機(jī)理的研究對(duì)發(fā)展病毒與宿主細(xì)胞相互作用的理論、抗病毒藥物的開發(fā)以減輕皰疹病毒對(duì)人類健康的威脅、減少牛業(yè)的巨大經(jīng)濟(jì)損失有重要意義。皰疹病毒等大DNA病毒能編碼DNA聚合酶等DNA復(fù)制相關(guān)蛋白,且能在靜止細(xì)胞甚至終末分化的神經(jīng)細(xì)胞中復(fù)制,因此過(guò)去認(rèn)為這些病毒的復(fù)制與細(xì)胞周期無(wú)關(guān),不需要細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白激酶(CDK)的活性。1998

2、年發(fā)現(xiàn),藥理學(xué)劑量的CDK抑制劑(PCI)能抑制單純皰疹病毒(HSV)的復(fù)制。此后,CDK在病毒復(fù)制過(guò)程中的作用備受關(guān)注,而HSV成為研究病毒與宿主細(xì)胞相互作用的首選模型。 目前對(duì)于HSV等病毒復(fù)制所需CDK種類還不清楚。根據(jù)文獻(xiàn)資料分析和我們的前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果,我們的假設(shè)是:CDK2可能是HSV復(fù)制和重新激活的關(guān)鍵性啟動(dòng)因素。本文以表達(dá)顯性負(fù)突變體CDK2(dn-CDK2)的HT29Tet-Ondn-CDK2細(xì)胞系、靶向Cycli

3、nA、CyclinE及CDK2的干擾RNA等多種措施抑制CDK2活性,研究CDK2在HSV復(fù)制中的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn),HSV在CDK2活性下降的HT29Tet-On dn-CDK2細(xì)胞中的增殖具有感染劑量依賴性；HSV感染宿主細(xì)胞6小時(shí)后CDK2活性被誘導(dǎo)；HSV增殖動(dòng)力學(xué)分析表明在宿主細(xì)胞CDK2活性被誘導(dǎo)后,HSV即進(jìn)入了快速增殖階段。這一發(fā)現(xiàn)首次直接證明了CDK2活性與HSV復(fù)制的關(guān)系。用微球菌核酸酶(MCN)消化進(jìn)行的嘗試性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)

4、:HSV感染CDK2下降細(xì)胞5小時(shí)后其基因組DNA仍以結(jié)構(gòu)緊密的染色體形式存在,HSV基因組的存在形式與宿主細(xì)胞CDK2活性有關(guān)。這一發(fā)現(xiàn)為進(jìn)一步研究CDK2調(diào)控HSV基因轉(zhuǎn)錄的機(jī)制提供了線索。 1.HSV在HT29Tet-On dn-CDK2細(xì)胞中的增殖特性HT29Tet-On dn-CDK2細(xì)胞整合了受Tet-On啟動(dòng)子調(diào)控的dn-CDK2基因,在強(qiáng)力霉素(Dox)誘導(dǎo)下大量表達(dá)dn-CDK2蛋白而抑制細(xì)胞CDK2的活性。將

5、HT29Tet-On dn-CDK2細(xì)胞在有和無(wú)Dox條件下培養(yǎng)48小時(shí),然后用不同劑量的HSV感染dn-CDK2誘導(dǎo)表達(dá)和未誘導(dǎo)表達(dá)的HT29Tet-On dn-CDK2細(xì)胞,24小時(shí)后收獲細(xì)胞,測(cè)定感染性HSV顆粒的生成量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：高感染劑量的HSV(大于1PFU/Cell)在dn-CDK2誘導(dǎo)表達(dá)和未誘導(dǎo)表達(dá)的HT29Tet-Ondn-CDK2細(xì)胞中的生長(zhǎng)無(wú)明顯差別,而低感染劑量(小于0.3PFU/Cell)的HSV感染dn-C

6、DK2誘導(dǎo)表達(dá)的HT29Tet-On dn-CDK2細(xì)胞24小時(shí)后感染性HSV顆粒的生成量較未誘導(dǎo)的HT29Tet-On dn-CDK2細(xì)胞中要低10倍以上。說(shuō)明HSV在dn-CDK2誘導(dǎo)表達(dá)的HT29Tet-On dn-CDK2細(xì)胞中的生長(zhǎng)具有感染劑量依賴性。這一現(xiàn)象與ICP0功能缺陷型HSV在培養(yǎng)細(xì)胞中的行為相似。提示細(xì)胞CDK2或者其產(chǎn)物有可能是HSV ICP0蛋白功能的替代者。 2.HSV復(fù)制與CDK2活性的關(guān)系為進(jìn)一步分析HS

7、V能在CDK2功能缺陷型宿主細(xì)胞HT29Tet-On dn-CDK2中增殖的原因,我們用HSV感染Dox充分誘導(dǎo)的HT29Tet-On dn-CDK2細(xì)胞,每隔3小時(shí)收獲細(xì)胞,測(cè)定CDK2的活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn),HSV感染6小時(shí)后,Dox誘導(dǎo)的HT29Tet-On dn-CDK2細(xì)胞中CDK2活性開始升高,9小時(shí)達(dá)到最大,12小時(shí)活性下降。HSV的增殖動(dòng)力學(xué)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn),HSV感染非誘導(dǎo)的HT29Tet-Ondn-CDK2細(xì)胞6小時(shí)時(shí)感染性H

8、SV顆粒的生成量最低,9小時(shí)后病毒產(chǎn)量上升。而感染dn-CDK2誘導(dǎo)表達(dá)的HT29Tet-On dn-CDK2細(xì)胞9小時(shí)時(shí)感染性HSV顆粒的生成量最低,12小時(shí)后病毒產(chǎn)量上升。較在未誘導(dǎo)的HT29Tet-On dn-CDK2細(xì)胞中的復(fù)制延遲3小時(shí)。這9小時(shí)恰好是CDK2活性被誘導(dǎo)所需要的時(shí)間,CDK2活性被誘導(dǎo)后HSV才進(jìn)入了快速?gòu)?fù)制階段。這一發(fā)現(xiàn)提示HSV的復(fù)制與CDK2活性密切相關(guān)；HSV通過(guò)誘導(dǎo)宿主細(xì)胞CDK2活性而促進(jìn)了其本身復(fù)

9、制的啟動(dòng)。 3.靶向CDK2的siRNA對(duì)HSV的復(fù)制的抑制作用為進(jìn)一步驗(yàn)證CDK2在HSV復(fù)制中的作用,我們構(gòu)建了靶向CDK2、CyclinA、CyclinE的siRNA表達(dá)載體,共轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞,觀察重組病毒HSV-GFP在CDK2活性被抑制的轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的基因表達(dá)情況。發(fā)現(xiàn)未轉(zhuǎn)染CDK2 siRNA的細(xì)胞HSV-GFP基因表達(dá)正常,而轉(zhuǎn)染CDK2 siRNA抑制了CDK2的活性后,HSV的HSV-GFP基因表達(dá)也受到了抑制

10、。進(jìn)一步證明了CDK2在HSV復(fù)制中的重要性。靶向CDK2、CyclinE和CyclinA的siRNA聯(lián)合作用對(duì)HSV復(fù)制的抑制程度最強(qiáng)。 4.宿主細(xì)胞CDK2活性對(duì)HSV染色體構(gòu)象的影響真核生物基因的轉(zhuǎn)錄活性與染色體的結(jié)構(gòu)狀態(tài)密切相關(guān)。我們推論上述HSV在CDK2活性下降細(xì)胞中的復(fù)制延遲可能與HSV染色體構(gòu)象有關(guān)。為驗(yàn)證這一假設(shè),我們提取了5PFU/Cell的HSV感染Dox誘導(dǎo)和非誘導(dǎo)的HT29Tet-Ondn-CDK2細(xì)胞5小時(shí)后

11、的細(xì)胞核,用微球菌核酸酶(MCN)消化染色體,電泳分離后印漬到硝酸纖維素膜上,用HSV基因探針雜交,測(cè)定HSV基因組被MCN消化程度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)HSV在感染CDK2活性正常的HT29Tet-On dn-CDK2細(xì)胞5小時(shí)后基因組DNA被MCN作用5分鐘即被降解成DNA片斷,而感染CDK2活性下降的HT29Tet-On dn-CDK2細(xì)胞5小時(shí)后HSV基因組被MCN作用30min仍然沒(méi)有降解,表明HSV基因組DNA可能與組蛋白結(jié)合緊密,以致