生長素受體SlTIR1-AFBs家族基因在番茄生長與發(fā)育中的調(diào)控機制研究.pdf

1、生長素作為一種重要的植物激素，參與植物生長和發(fā)育諸多過程以及調(diào)控許多生理反應。生長素通過介導其受體 TIR1/AFB與轉錄抑制子 Aux/IAA蛋白直接相互作用，促使 Aux/IAA蛋白降解，將下游的轉錄因子 ARF去抑制化，從而激活生長素信號通路，使得植物最終表現(xiàn)出生理反應。植物對生長素的響應是一個極其復雜的過程，存在著嚴密的調(diào)控機制。因此，研究生長素的作用機制對深入認識植物生長發(fā)育的生理過程有著重要的意義。
　　番茄是一種重要

2、經(jīng)濟作物，也是研究一些重要性狀，如：復葉、聚傘花序以及果實發(fā)育、成熟的模式植物。TIR1/AFB蛋白作為生長素受體，處于生長素信號通路中關鍵位置，研究生長素受體基因功能至關重要。但是生長素受體及信號轉導對番茄復葉及花器官發(fā)育、果實形成的調(diào)控機制仍缺乏了解。
　　本論文以番茄為研究材料，通過生物信息學、遺傳轉化、組織切片法、生理生化、分子生物學等方法分析了 SlTIR1/AFBs基因家族成員的結構、表達、蛋白互作特性及其功能，以期揭

3、示生長素受體 SlTIR1/AFBs同源基因家族成員對番茄生長、發(fā)育調(diào)控功能的差異性以及在生長素信號中調(diào)控方式，同時闡明 SlmiR393在轉錄后介導生長素受體基因調(diào)控影響番茄發(fā)育的作用機制。這些研究結果為深入闡明生長素信號對番茄生長與發(fā)育的分子調(diào)控機理具有重要意義，也為生產(chǎn)實踐提供理論依據(jù)。本文主要研究結果如下：
　?、偻ㄟ^同源序列比對分析發(fā)現(xiàn)，番茄基因組中含有4個 SlTIR1/AFBs生長素受體基因家族成員。基因組結構分析發(fā)

4、現(xiàn)，SlTIR1/AFBs基因家族都由2個內(nèi)含子、2-4個外顯子、高度保守的 F-BOX結構域和多個亮氨酸富集重復（LRR）結構域組成。系統(tǒng)進化樹分析發(fā)現(xiàn)，番茄 SlTIR1/AFBs基因家族成員分別歸屬為 TIR1、AFB4及AFB6三個亞家族。
　?、谕ㄟ^定量PCR技術檢測，發(fā)現(xiàn)SlTIR1A、SlTIR1B、SlAFB4與SlAFB6基因在番茄生長與發(fā)育階段中具有不同的表達模式。同時，proSlTIR1/AFBs-GUS融合

5、表達轉基因株系的 GUS組織化學染色觀察發(fā)現(xiàn)，SlTIR1A主要在花器官中的萼片、花藥、子房以及早期果實中的胎座部位表達；SlTIR1B主要在葉柄、葉脈，子房中胚珠以及早期發(fā)育果實的胎座、果皮上表達；SlAFB4主要在側根、花器官中萼片、柱頭、果皮、果肉上表達；SlAFB6主要在葉柄、萼片、花藥、果皮部位表達。這說明 SlTIR1/AFBs家族基因的表達模式既有組織特異性，也有相似性。此外，采用 qPCR定量技術和 proSlTIR1/

6、AFBs-GUS融合表達轉基因株系 GUS組織化學染色分析發(fā)現(xiàn)，外源生長素(IAA)明顯抑制 SlTIR1/AFBs基因表達，說明SlTIR1/AFBs轉錄本受到外源生長素負調(diào)控作用。
　　③亞細胞定位顯示 Sl-TIR1A、Sl-TIR1B、Sl-AFB4及 Sl-AFB6受體蛋白均位于細胞核中。通過酵母雙雜交法(Y2H)和雙分子熒光互補技術(BiFC)對番茄 Sl-TIR1/AFBs生長素受體蛋白的功能進行鑒定。結果表明：Sl

7、-TIR1/AFBs與 ASK1蛋白進行互作形成TIR1/AFB-ASK1蛋白復合體；Sl-TIR1/AFBs受體蛋白能與At-IAA7蛋白以依賴于生長素的方式相互作用。同時，對 Sl-TIR1/AFBs蛋白功能結構域分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)-BOX結構域是Sl-TIR1/AFBs-ASK1蛋白復合體形成必需的。F-BOX與多個亮氨酸富集重復(LRR)結構域影響Sl-TIR1/AFBs與Aux/IAA蛋白結合的穩(wěn)定性。因此，推測番茄 SlTIR1/

8、AFBs生長素受體同源基因表現(xiàn)出受體蛋白相似的功能與特征。
　　④通過超量表達或 RNAi抑制表達方式對番茄 SlTIR1/AFBs基因家族成員進行調(diào)控表達。結果表明：在超量表達和RNAi抑制表達轉基因植株中SlTIR1/AFBs基因的表達水平都有不同程度的上調(diào)或下調(diào)。對轉基因番茄幼苗進行生長素反應分析發(fā)現(xiàn)，SlTIR1A/B比其他兩個家族成員 SlAFB4、SlAFB6更能影響番茄對生長素敏感性。
　?、萃ㄟ^酵母雙雜交法(

9、Y2H)和雙分子熒光互補技術(BiFC)證實了番茄中 Sl-TIR1/AFBs與 Sl-Aux/IAAs蛋白互作是依賴于生長素，明確了番茄不同 Sl-TIR1/AFBs生長素受體對 Aux/IAAs蛋白的特異性結合調(diào)控方式。通過定量 PCR技術檢測參與生長素信號通路兩個重要家族基因 Aux/IAA與 ARF的轉錄水平在轉基因株系中變化情況，結果表明：SlTIR1A、SlTIR1B、SlAFB4與 SlAFB6在轉錄水平上不同程度對Aux

10、/IAA及ARF基因進行特異地調(diào)控。
　　⑥對轉基因株系的功能鑒定發(fā)現(xiàn)：超量表達 SlTIR1A影響花器官的發(fā)育及導致番茄座果不依賴于授粉/授精作用。同時，從組織切片法、生理生化與分子生物學等方面分析，初步揭示了 SlTIR1A參與果實起始發(fā)育的作用機理；超量表達SlTIR1B的轉基因株系出現(xiàn)生長素相關多效性的表型，如：頂端優(yōu)勢減弱、促進腋芽發(fā)育、改變?nèi)~片形態(tài)、子房發(fā)育、果實形態(tài)等。這也表明 SlTIR1B作為生長素信號正調(diào)控因子

11、，影響了番茄營養(yǎng)生長與果實發(fā)育；下調(diào)表達 SlAFB4影響番茄側根的形成。這體現(xiàn)了 SlTIR1/AFBs基因家族成員在番茄生長、發(fā)育過程中發(fā)揮著不同的調(diào)控作用。
　?、叱勘磉_Sl-miR393導致SlTIR1A、SlTIR1B、SlAFB6 mRNA水平下調(diào)，且在不同組織中靶基因表達被下調(diào)程度不一致，說明 SlmiR393在轉錄后調(diào)控靶基因具有組織特異性。對SlAFB6基因與Sl-miR393特異結合位點進行定點突變，構建了不

12、受SlmiR393剪切的SlAFB6(mSlAFB6)且不改變蛋白序列，并對mSlAFB6進行超量表達。通過對轉基因株系的功能鑒定發(fā)現(xiàn)：超量表達mSlAFB6對番茄復葉發(fā)育和萼片形態(tài)產(chǎn)生影響，如葉片融合、葉片細胞形態(tài)改變、葉脈結構改變以及萼片融合。RNA-seq轉錄組分析表明：22個 DEG與生長素代謝、運輸及信號轉導相關，以及27個 DEG參與調(diào)控側生器官發(fā)育的轉錄因子。這也說明SlmiR393介導 SlAFB6調(diào)控影響番茄側生器官邊