探究纖連蛋白和解聚素—金屬蛋白酶-8在椎間盤(pán)退變中的關(guān)系.pdf

1、背景:
　　椎間盤(pán)退變是腰背痛的主要原因之一，是多因素協(xié)同共同作用的結(jié)果，椎間盤(pán)退變已成為臨床上的常見(jiàn)問(wèn)題，不僅給患者帶來(lái)極大的痛苦，同時(shí)也消耗了大量醫(yī)療資源。然而椎間盤(pán)產(chǎn)生退變的病理機(jī)制尚不完全清楚，現(xiàn)階段大部分病人通過(guò)手術(shù)治療來(lái)緩解疼痛癥狀。椎間盤(pán)的退變過(guò)程不僅僅表現(xiàn)在形態(tài)學(xué)上的變化，更伴隨著椎間盤(pán)的組織學(xué)和生化性質(zhì)的系統(tǒng)性改變，其中椎間盤(pán)組織細(xì)胞外基質(zhì)成分的丟失，導(dǎo)致結(jié)合水能力下降和蛋白降解這兩種因素尤為重要。近年來(lái)隨著實(shí)驗(yàn)

2、設(shè)備的改良和實(shí)驗(yàn)手段的改進(jìn)，對(duì)椎間盤(pán)組織的分子生物學(xué)、免疫學(xué)、病理生理學(xué)及生物力學(xué)等方面研究不斷深入，這些研究將引導(dǎo)出治療椎間盤(pán)退變的新理論和方法。
　　纖連蛋白(Fibronectin FN)，是在細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)和血漿中發(fā)現(xiàn)的一種多功能糖蛋白，整個(gè)分子呈V形，它至少有20中變異體存在，這些亞單位為同一基因的表達(dá)產(chǎn)物，只是在轉(zhuǎn)錄后RNA的剪接上有所差異，因而產(chǎn)生不同的mRNA。纖連蛋白廣泛分布于血漿、多種細(xì)胞表面及細(xì)胞外基質(zhì)

3、中。它在細(xì)胞黏附和遷移，細(xì)胞分化，細(xì)胞功能中起著重要的作用，具有多種生物活性。近年來(lái)對(duì)纖連蛋白和纖連蛋白片段在慢性疾病中的作用相關(guān)研究逐漸增多。
　　解聚素-金屬蛋白酶家族（A Disintegrin And MetalloproteinaseFamily），為1型跨膜蛋白（含鋅蛋白酶總家族），也叫去整合素-金屬蛋白酶或者M(jìn)DC。是錨定在細(xì)胞膜的細(xì)胞表面蛋白質(zhì)家族。在調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)的水解，細(xì)胞-細(xì)胞和細(xì)胞-基質(zhì)的相互作用中至關(guān)重要

4、。該家族涉及到膜融合（細(xì)胞粘連和細(xì)胞融合），細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子的脫落，細(xì)胞遷徙的控制，以及某些進(jìn)程肌肉發(fā)育，受精和細(xì)胞結(jié)局的決定。病理學(xué)中，炎癥和腫瘤也受到該家族影響。
　　纖連蛋白在關(guān)節(jié)和軟骨中的作用已經(jīng)被廣泛研究，但其在椎間盤(pán)退變中的作用相關(guān)研究不多，認(rèn)為FN以及FN-f含量的變化與椎間盤(pán)退變過(guò)程有關(guān)。相關(guān)研究表明ADAM-8在關(guān)節(jié)軟骨中能夠在特定位點(diǎn)將FN剪切為含有N-末端到VRAA271位點(diǎn)的FN-f,從而使該FN-f含量

5、不斷積累增加，F(xiàn)N失去原有的生物作用和功能而加重軟骨退變過(guò)程。由于軟骨和椎間盤(pán)組織細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)的相似性，通過(guò)對(duì)人椎間盤(pán)組織和ADAM-8轉(zhuǎn)基因老鼠進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)來(lái)探究ADAM-8和FN在椎間盤(pán)退變發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中的關(guān)系。從而為治療椎間盤(pán)退變疾病提供一些新研究方向和治療方法。
　　第一部分，ADAM-8對(duì)于人椎間盤(pán)樣品中的FN作用和影響
　　目的:
　　通過(guò)手術(shù)病人和器官捐贈(zèng)者的椎間盤(pán)樣品，進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)確定在人椎間盤(pán)不

6、同退變等級(jí)中ADAM-8基因的表達(dá)對(duì)纖連蛋白以及纖連蛋白片段的作用和影響。
　　方法:
　　1.人椎間盤(pán)樣品的選擇和收集。選取脊柱手術(shù)病人和器官捐贈(zèng)者的椎間盤(pán)NP和AF組織在含有蛋白酶抑制劑的1*PBS洗滌后低溫在-80℃冰箱保存。
　　2.人椎間盤(pán)組織中定性定量蛋白質(zhì)檢測(cè)(Western Blot)，在不同等級(jí)人椎間盤(pán)退變組織中檢測(cè)全長(zhǎng)FN和特定FN-f以及它們的含量變化。
　　3.通過(guò)定性蛋白質(zhì)檢測(cè)和免疫組化

7、方法來(lái)觀測(cè)人椎間盤(pán)中ADAM-8的存在和分布情況。
　　結(jié)果:
　　1.在人椎間盤(pán)組織中，纖連蛋白N-末端抗體(MAB1936)和(VRAA271位點(diǎn))能特異性識(shí)別全長(zhǎng)FN以及含有N-末端到VRAA271位點(diǎn)的FN-f。
　　2.在人椎間盤(pán)組織中特定纖連蛋白片段的含量隨著椎間盤(pán)退變程度增加而上升。
　　3.通過(guò)Western blot定性檢測(cè)和免疫組化染色觀測(cè)到ADAM-8存在于成年人椎間盤(pán)NP和AF組織中，并且

8、能在特定位點(diǎn)剪切FN。
　　4.在人椎間盤(pán)組織中成熟ADAM-8含量隨著椎間盤(pán)退變級(jí)別增加而上升。
　　結(jié)論:
　　1.通過(guò)實(shí)驗(yàn)在人椎間盤(pán)組織中首次鑒定了含有N-末端到VRAA271位點(diǎn)的纖連蛋白片段。
　　2.在人椎間盤(pán)組織中發(fā)現(xiàn)FN-f含量隨著椎間盤(pán)退變程度增加而上升。
　　3.們?cè)谌俗甸g盤(pán)中通過(guò)蛋白定性檢測(cè)確定了ADAM-8的存在，并且發(fā)現(xiàn)其能夠在特定位點(diǎn)將FN剪切為FN-f。
　　4.通過(guò)研究

9、，在人椎間盤(pán)組織中，成熟ADAM-8含量隨著椎間盤(pán)退變級(jí)別增加而上升，與FN-f含量變化趨勢(shì)相同。表明FN-f和ADAM-8在椎間盤(pán)退變的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中有重要作用。
　　第二部分，兩種轉(zhuǎn)基因小鼠椎間盤(pán)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)觀測(cè)ADAM-8對(duì)纖連蛋白的作用和影響
　　目的:
　　通過(guò)ADAM-8轉(zhuǎn)基因老鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步確定，在椎間盤(pán)退變中ADAM-8基因的表達(dá)對(duì)纖連蛋白以及纖連蛋白片段的作用和影響。
　　方法:
　　1.

10、在固定時(shí)間點(diǎn)收集敲除型(KO)和野生型(WT)兩種基因型的ADAM-8轉(zhuǎn)基因小鼠腰椎間盤(pán)樣品，從組織學(xué)染色觀測(cè)兩者椎間盤(pán)退變過(guò)程。
　　2.定性蛋白檢測(cè)來(lái)研究ADAM-8和FN-fs在椎間盤(pán)退變發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中的作用。
　　結(jié)果:
　　1.HE染色組織學(xué)定期觀測(cè)結(jié)果顯示，ADAM-8野生型(WT)型轉(zhuǎn)基因小鼠椎間盤(pán)退變程度明顯高于ADAM-8敲除型(KO)型轉(zhuǎn)基因小鼠。
　　2.Western blot蛋白檢測(cè)顯