番茄果實(shí)后熟與葉片衰老相關(guān)的SlWRKY轉(zhuǎn)錄因子功能分析.pdf

1、番茄（Solanum lycopersicum）是典型的呼吸躍變型果實(shí)，在后熟過程中發(fā)生了許多重要的生理變化。在激素水平上，伴隨著乙烯的大量合成；在顏色轉(zhuǎn)變上，葉綠素的降解和番茄紅素的合成使番茄果實(shí)在外觀上由綠轉(zhuǎn)紅；在果實(shí)質(zhì)地上，由于水解酶的作用使果實(shí)逐漸軟化。WRKY轉(zhuǎn)錄因子是植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，已有的研究表明 WRKY轉(zhuǎn)錄因子在植物形態(tài)建成、物質(zhì)代謝、生物及非生物脅迫響應(yīng)等過程中發(fā)揮了重要的調(diào)控作用。近年來在擬南芥、水稻等模式植

2、物上的研究已經(jīng)表明 WRKY轉(zhuǎn)錄因子參與了對植物葉片衰老的調(diào)控，但對采后果實(shí)后熟調(diào)控方面的研究非常罕見。本論文在本課題組的研究基礎(chǔ)上，以番茄為實(shí)驗(yàn)材料，分析了對乙烯產(chǎn)生明顯響應(yīng)的SlWRKY在葉片和果實(shí)中的表達(dá)模式、篩選其下游基因、驗(yàn)證與其互作的蛋白，從多方面進(jìn)一步探討了 WRKY轉(zhuǎn)錄因子是否參與了番茄果實(shí)后熟階段的調(diào)控。主要研究結(jié)果如下：
　　1、采用熒光定量技術(shù)檢測了9個(gè) SlWRKY基因在四個(gè)發(fā)育時(shí)期的番茄葉片，六個(gè)自然成熟

3、時(shí)期番茄果實(shí)中的實(shí)時(shí)表達(dá)情況。結(jié)果表明，（1）SlWRKY16、SlWRKY17、SlWRKY22、SlWRKY23、SlWRKY25、SlWRKY31、SlWRKY33、SlWRKY53、SlWRKY54都在葉片初始進(jìn)入衰老狀態(tài)時(shí)表達(dá)量最高，其中 SlWRKY25、SlWRKY33、SlWRKY54的變化幅度最大，相對幼葉的表達(dá)量升高了160-200倍；（2）SlWRKY16、SlWRKY17、SlWRKY22、SlWRKY23、Sl

4、WRKY25、SlWRKY31、SlWRKY33、SlWRKY53、SlWRKY54在番茄果實(shí)成熟期都有不同程度的上調(diào)表達(dá)，但具有不同的上調(diào)模式。（3）SlWRKY16、SlWRKY17、SlWRKY23、SlWRKY25表達(dá)量在粉紅期出現(xiàn)峰值，SlWRKY31、SlWRKY33、SlWRKY53、SlWRKY54在全紅期的表達(dá)量達(dá)到峰值。SlWRKY22的表達(dá)量則呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢。
　　2、使用熒光共聚焦顯微鏡觀察融合YFP的

5、重組載體在本氏煙草中的表達(dá)情況，結(jié)果表明：SlWRKY17、SlWRKY22、SlWRKY23、SlWRKY25、SlWRKY31、SlWRKY33、SlWRKY53、SlWRKY54均定位于細(xì)胞核。
　　3、將啟動子活性載體和過表達(dá)載體共同轉(zhuǎn)化煙草葉片，檢測SlWRKYs對衰老相關(guān)基因啟動子活性的影響，數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示：SlWRKY對SlACO1、SlACO3、SlPAO的啟動子活性沒有產(chǎn)生明顯影響；SlWRKY16、SlWRK

6、Y23、SlWRKY33、SlWRKY53使SlPPH啟動子的提高了2-3倍，SlWRKY25使SlPDS的啟動子活性上升了6倍。SlWRKY16、SlWRKY17也使SlPSY1的啟動子活性有2-3倍的提高。SlWRKY16和SlWRKY17的共同作用則表現(xiàn)出對SlPSY1啟動子更加強(qiáng)烈的調(diào)控作用，使其活性提高了接近4倍。
　　4、通過熒光雙分子互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證SlWRKYs與轉(zhuǎn)錄因子SlERF2b、SlERF7、SlRIN之間是否

7、存在相互作用。結(jié)果表明，SlERF2b與 SlWRKY17、SlWRKY54，SlERF7與 SlWRKY17、SlWRKY33，SlRIN與 SlWRKY17、SlWRKY53、SlWRKY17與SlWRKY16、SlWRKY54之間均存在蛋白水平的互作關(guān)系。
　　5、對SlWRKY23、SlWRKY53進(jìn)行原核表達(dá)，并純化獲得高純度的蛋白。這些蛋白在體外與包含W-box的核酸探針反應(yīng)，結(jié)果顯示SlWRKY23能夠與SlACO1