試用基因缺陷、蛋白空間結(jié)構(gòu)改變淺析DMD發(fā)病機(jī)制.pdf

1、Duchenne型肌營養(yǎng)不良癥(DuchenneMuscularDystrophy,DMD)是一種X連鎖隱性遺傳病，臨床特征為進(jìn)行性四肢近端骨骼肌萎縮無力、小腿腓腸肌假性肥大，一般3-5歲起病，病情進(jìn)行性進(jìn)展，12歲左右喪央行走能力，多于20歲左右死于呼吸衰竭和/或心力衰竭。其病因是由于X染色體的抗肌萎縮蛋白基因突變，導(dǎo)致其編碼的細(xì)胞骨架蛋白dystrophin缺乏。Becker型進(jìn)行性肌營養(yǎng)不良(Beckermusculardystr

2、ophy，BMD)臨床表現(xiàn)與DMD相似但病情較輕，15歲以上仍保持行走能力。DMD和BMD雖均由同一基因突變所致但臨床表型差別較大，DMD被認(rèn)為是致死性的而BMD則相對良性，生存期較長，生活質(zhì)量較高。 DMD/BMD的致病基因被定位于X染色體短臂2區(qū)1帶(Xp21)，于1987年通過反向遺傳學(xué)的方法克隆成功，長度大約為2.4Mb，是目前為止發(fā)現(xiàn)的人類最大的基因之一，占整個X染色體的2％及人類基因組的0.05％。該基因90％的序列

3、為內(nèi)含子，其cDNA全長14kb，共有79個外顯子，編碼的蛋白產(chǎn)物被命名為dystrophin，即抗肌萎縮蛋白。 DMD基因突變率為1/10000，遠(yuǎn)高于其他基因的突變率。突變形式有多種，其中缺失占60-65％，重復(fù)占5-10％，其余30-35％可能是點(diǎn)突變或?yàn)槌Ｒ?guī)方法檢測不到的基因片段缺失或重復(fù)。DMD基因的缺失分布存在兩個熱點(diǎn)區(qū)，分別位于5’氨基端和中央?yún)^(qū)，前者累及外顯子3～19占總?cè)笔У?0％左右，后者累及外顯子44～53

4、占總?cè)笔У?0％左右。Monaco于1988年提出了閱讀框原則，認(rèn)為若基因缺失或重復(fù)突變打破了閱讀框或造成閱讀框移碼，致使dystrophin表達(dá)嚴(yán)重障礙，則產(chǎn)生典型的DMD；若基因突變時鄰近的外顯子能保持閱讀框不變而尚有部分dystrophin表達(dá)，則臨床癥狀較輕表現(xiàn)為BMD。我國學(xué)者張成等通過對65例整碼缺失DMD患者的研究發(fā)現(xiàn)，dystrophin蛋白存在4個疏水肽段，其中第3個肽段的疏水性最強(qiáng)，由51號外顯子編碼。75％的DMD

5、這個疏水肽段消失，98％的BMD缺失不累及這個疏水肽段，提出若整碼缺失累及了缺失熱區(qū)肽段，則基本是DMD。Dystrophin的絞鏈3區(qū)對維持dystrophin的彈性、柔韌性及維護(hù)細(xì)胞膜的穩(wěn)定性方面有重要的作用，所以該區(qū)域的破壞將導(dǎo)致嚴(yán)重的臨床表型。但以上理論尚未解決DMD整碼缺失造成抗肌萎縮蛋白的結(jié)構(gòu)縮短后如何影響其空間結(jié)構(gòu)導(dǎo)致DMD發(fā)生的機(jī)制。因此，弄清一級結(jié)構(gòu)改變后抗肌萎縮蛋白空間結(jié)構(gòu)的變化，對于闡明抗肌萎縮蛋白的重要結(jié)構(gòu)功能區(qū)

6、和DMD發(fā)病機(jī)制有重要意義。 本實(shí)驗(yàn)的目的是通過研究dystrophin基因外顯子缺失類型、缺失前后蛋白質(zhì)疏水性質(zhì)改變和空間結(jié)構(gòu)異常與臨床表型的關(guān)系，初步探討缺失后蛋白空間結(jié)構(gòu)功能改變對臨床表型的影響及可能的發(fā)病機(jī)制。 材料和方法一病例資料收集整理本院2002年至2005年104例確診DMD/BMD患者的基因檢測結(jié)果，并利用其中59例缺失型突變的DMD/BMD患者臨床和基因檢測資料分析基因缺失類型和臨床表型的關(guān)系。

7、 二ORFFinder程序預(yù)測抗肌萎縮蛋白的一級結(jié)構(gòu)利用信息生物學(xué)的數(shù)據(jù)庫搜索，生物軟件分析等方法完成dystropin蛋白關(guān)鍵區(qū)段的分析，通過ORFFinder程序預(yù)測dystrophin基因外顯子缺失前后dystrophin蛋白的一級結(jié)構(gòu)，用Bioedit軟件作突變前后序列比較分析以對比基因突變后dystrophin一級結(jié)構(gòu)的改變。 三Bioedit軟件分析抗肌萎縮蛋白的疏水性由于移碼突變時終止密碼提前出現(xiàn)致使翻譯提前終止

8、，影響到dystrophin的重要功能區(qū)如富含半胱氨酸區(qū)和羧基端，所以根據(jù)移碼突變不易分析dystrophin的關(guān)鍵區(qū)段，因此本實(shí)驗(yàn)將用Bioedit軟件對本組整碼突變后的dystrophin蛋白作Kyte&Doolittle平均疏水輪廓分析，研究突變后蛋白疏水區(qū)段改變與臨床表型的關(guān)系。 四SWISS-MODEL同源模構(gòu)法模建并分析抗肌萎縮蛋白的功能區(qū)Dystrophin蛋白是一個有3685個氨基酸的巨大蛋白，由于模板的限制，目

9、前同源模構(gòu)方法不可能構(gòu)建整個dystrophin蛋白的三維模型，所以本實(shí)驗(yàn)將嘗試使用SWISS-MODEL服務(wù)器構(gòu)建dystrophin的3個重要功能區(qū)：氨基端、第三鉸鏈區(qū)、富含半胱氨酸區(qū)的三維模型。將dystrophin的氨基酸序列提交到SWISS-MODEL服務(wù)器后，服務(wù)器即在ExPdb晶體圖像數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行相似性搜索。搜索結(jié)果顯示有三個最佳對比區(qū)域，網(wǎng)站用“Batch”表示這些最佳對比區(qū)域，分別位于序列的第4～251位氨基酸殘基(B

10、atch2)、2470～2585位氨基酸殘基(Batch3)、3042～3311位氨基酸殘基(Batchl)，對應(yīng)的是dystrophin蛋白氨基端及與之相連的中央?yún)^(qū)的前10個氨基酸、第三鉸鏈區(qū)的大部分、富含半胱氨酸區(qū)及與之緊接的羧基端前部的11個氨基酸，服務(wù)器將為這些區(qū)域建模。所以Batchl、Batch2、Batch3將看作是富含半胱氨酸區(qū)、氨基端、第三鉸鏈區(qū)三維模型。然后用生物軟件和數(shù)據(jù)庫搜索對比等方法分析這三個模型。 結(jié)

11、果一DMD基因突變類型104例確診DMD/BMD患者中缺失型59例(56.8％)，重復(fù)型12例(11.5％)，未檢出缺失或重復(fù)(可能是點(diǎn)突變或其它形式突變)33例(31.7％)。59例缺失型突變主要分布在5′端缺失熱區(qū)外顯子3～11區(qū)域占總?cè)笔У?0.2％和中央缺失熱區(qū)外顯子44～54占總?cè)笔У?8.1％，51號外顯子缺失頻率最高(8.7％)。59例缺失型突變中共有50例移碼突變，9例整碼突變，移碼突變均為DMD，4例BMD患者均為整碼

12、突變。 二整碼缺失及疏水性9例整碼突變中累及第三疏水峰的5例，4例為DMD(均為51～52號外顯子缺失)，1例BMD(45～53號外顯子缺失)。 三3號外顯子缺失抗肌萎縮蛋白空間結(jié)構(gòu)的改變3號外顯子缺失后dystrophin的氨基端三維模型變化不大但空間位置發(fā)生扭轉(zhuǎn)。Pafm數(shù)據(jù)庫同源性搜索顯示3號外顯子缺失后，dystrophin蛋白的氨基端的第一個Calponin同源區(qū)即CH1區(qū)(Calponinhomologydo

13、main)的命中指數(shù)(Score)由108下降至36.5，期望值(Evalue)由2.3e-29升高至8.1e-08，其余結(jié)構(gòu)區(qū)完整。從dystrophin肌動蛋白結(jié)合區(qū)域晶體模型分析，3號外顯子缺失后肌動蛋白結(jié)合區(qū)域的CH1區(qū)C螺旋缺失。 結(jié)論1肌營養(yǎng)不良的臨床表型輕重與外顯子的缺失數(shù)目不呈平衡關(guān)系，與缺失是否破壞閱讀框有關(guān)。整碼突變累及第三疏水峰臨床表型多為DMD。 2WW區(qū)、富含半胱氨酸區(qū)和羧基端區(qū)是dystrop

14、hin的重要結(jié)構(gòu)區(qū)域，直接或間接累及這些區(qū)域的突變臨床表現(xiàn)為DMD。 3蛋白的空間結(jié)構(gòu)改變決定其臨床表型的輕重，移碼突變后蛋白空間結(jié)構(gòu)改變大甚至不能合成dystrophin，臨床表現(xiàn)為DMD，整碼突變對蛋白的空間結(jié)構(gòu)影響較移碼突變小，臨床表現(xiàn)為BMD。 43號外顯子缺失后蛋白的氨基端空間位置可能發(fā)生扭轉(zhuǎn)，氨基端肌動蛋白結(jié)合區(qū)域的CH1區(qū)螺旋區(qū)C缺失，影響了dystrophin與肌動蛋白的結(jié)合功能，但其他主要功能區(qū)功能仍存