羅氏海盤(pán)車(chē)（Asterias Rollestoni）體壁膠原蛋白的分離純化及其部分生物學(xué)功能的研究.pdf

1、羅氏海盤(pán)車(chē)是一種廣泛分布于我國(guó)沿海地區(qū)的海星綱棘皮動(dòng)物，其體壁中含有豐富的膠原蛋白。膠原蛋白作為細(xì)胞外基質(zhì)中起支持作用的主要成分，具有“Gly-X-Y”的特異性氨基酸組成和螺旋結(jié)構(gòu)，因其還具有抗原性低、可生物降解性強(qiáng)、生物相容性好等優(yōu)點(diǎn)，故在生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、食品科學(xué)和美容業(yè)等領(lǐng)域中具有巨大的研究開(kāi)發(fā)潛力和廣闊的應(yīng)用前景。 國(guó)內(nèi)外對(duì)膠原蛋白的分離制備主要以哺乳動(dòng)物皮膚、軟骨以及魚(yú)類皮膚等組織為原料，對(duì)其研究主要集中在分離制備和生物材

2、料領(lǐng)域的開(kāi)發(fā)應(yīng)用方面。到目前為止，對(duì)棘皮動(dòng)物膠原蛋白的研究仍比較少，而對(duì)羅氏海盤(pán)車(chē)體壁膠原蛋白的分離純化及其生物學(xué)功能還未見(jiàn)報(bào)道。為了充分開(kāi)發(fā)和利用我國(guó)沿海豐富的海盤(pán)車(chē)資源，建立羅氏海盤(pán)車(chē)體壁膠原蛋白的分離制備和純化方法，查清其對(duì)體外培養(yǎng)的角膜細(xì)胞、皮膚細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)功能，探索其在臨床眼科、醫(yī)學(xué)美容和腫瘤生物學(xué)應(yīng)用的可能性，本文以羅氏海盤(pán)車(chē)體壁為原料，利用改良的酶解法分離純化出了膠原蛋白，并用所得膠原蛋白純化樣品對(duì)體外培養(yǎng)的角膜

3、細(xì)胞、皮膚細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞進(jìn)行了生物學(xué)功能研究，獲得了較好的效果。為利用海盤(pán)車(chē)體壁膠原蛋白研制角膜組織工程支架材料、美容材料和抗腫瘤研究奠定了理論基礎(chǔ)和技術(shù)條件，具有重要的科學(xué)意義和巨大的開(kāi)發(fā)價(jià)值。 本文首先分別采用酸抽提法、中性鹽抽提法和酶解法從羅氏海盤(pán)車(chē)體壁中提取膠原蛋白，通過(guò)將三種方法進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)酶解法提取結(jié)果明顯高于酸抽提法和中性鹽抽提法。所以，在對(duì)酶解法提取步驟進(jìn)行了適當(dāng)?shù)母牧己螅瑢⑵渥鳛樽罱K抽提方法。所提膠原蛋白產(chǎn)物

4、經(jīng)凝膠柱純化后，對(duì)該純化樣品進(jìn)行生化性質(zhì)的測(cè)定，并將其作為細(xì)胞培養(yǎng)添加物檢測(cè)其對(duì)家兔角膜基質(zhì)細(xì)胞(RCK)、新西蘭大白兔角膜內(nèi)皮(NCE)細(xì)胞、人胚胎皮膚成纖維細(xì)胞(ESF)和HeLa細(xì)胞的生物學(xué)功能。 生化性質(zhì)的測(cè)定結(jié)果表明，所得膠原蛋白純化樣品由分子量分別為87.9kDa和84.OkDa的兩種α鏈組成，產(chǎn)物中蛋白含量為97.5％，羥脯氨酸含量為9.75％，多糖含最為0.6％。 所得膠原蛋白純品對(duì)體外培養(yǎng)角膜細(xì)胞的生物

5、學(xué)功能實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：不同濃度的膠原蛋白作為角膜內(nèi)皮和基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)液添加物均可不同程度提高細(xì)胞的貼壁速率和增殖速率，其中l(wèi)mg／mL和10mg／mL濃度膠原蛋白促角膜細(xì)胞貼壁和促增殖作用明顯。 膠原蛋白純品對(duì)體外培養(yǎng)皮膚成纖維細(xì)胞的生物學(xué)功能實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組中不同濃度膠原蛋白均可促進(jìn)皮膚成纖維細(xì)胞貼壁速率，其中10mg／mL濃度和30mg／mL濃度膠原蛋白促皮膚成纖維細(xì)胞貼壁作用顯著。不同濃度膠原蛋白對(duì)皮膚成纖維細(xì)胞增殖影響的

6、實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不同濃度膠原蛋白均不同程度促進(jìn)皮膚成纖維細(xì)胞增殖速率，其中10mg／mL濃度膠原蛋白促皮膚成纖維細(xì)胞增殖作用顯著。 膠原蛋白純品對(duì)HeLa細(xì)胞生物學(xué)功能試驗(yàn)結(jié)果顯示，不同濃度膠原蛋白均可促進(jìn)HeLa細(xì)胞的貼壁速率和增殖速率，其中10mg／mL濃度和60mg／mL濃度膠原蛋白促HeLa細(xì)胞貼壁作用顯著，10mg／mL濃度膠原蛋白促HeLa細(xì)胞增殖作用顯著。 由以上結(jié)果可知，所提膠原蛋白純品作為細(xì)胞培養(yǎng)添加物對(duì)