IL-18基因單核苷酸多態(tài)性生物信息學研究與臨床評價.pdf

1、研究背景 近年來人類基因組計劃和其它物種基因組計劃的啟動和實施，使人類在生命科學領域尤其是核酸和蛋白質(zhì)等生物大分子的序列、結構與功能等領域迅速積累了大量數(shù)據(jù)。人們渴求新知的愿望促使人們?nèi)ネ诰蜻@些巨量數(shù)據(jù)。由生命科學和信息技術等學科相結合而形成的新興交叉學科一生物信息學應運而生。在應用研究方面，生物信息學在尋找人類疾病基因、預測基因和蛋白質(zhì)表達的結構及功能和合理設計藥物等方面都起著至關重要的作用。 隨著分子遺傳學的進展，疾

2、病遺傳學研究從簡單的單基因疾病轉(zhuǎn)向于復雜的多基因疾病(如免疫相關疾病、心血管疾病、各種腫瘤等)的研究中。目前認為基因單核苷酸多態(tài)性(SNP)及其特定的組合可能是造成宮頸癌等一些復雜性狀疾病易感性的最重要的原因。但尋找與疾病表型相關的遺傳位點并非是一項容易的工作。據(jù)估計，人類30億堿基中大約有數(shù)百萬個SNPs位點。因此，在疾病分子流行病學研究中如何進行基因多念性研究?在如此眾多的基因及SNP位點中選擇哪些基因以及哪些SNPs位點進行研究?

3、這些已成為許多醫(yī)學研究工作者共同關注的問題。本研究以分析細胞因子IL-18基因重要單核苷酸多態(tài)性位點為例，探討生物信息學篩選疾病基因SNP 位點的方法，并臨床評價方法的有效性。研究目的和意義： 1、采用生物信息學策略篩選細胞因子IL-18基因重要單核苷酸多態(tài)性位點，建立一種篩選疾病相關SNP 位點的方法； 2、以宮頸癌疾病為例，檢測選定的IL-18基因SNP 位點基因型，臨床評價此SNP是否與宮頸癌相關，從基因水平驗證生

4、物信息學篩選策略的有效性； 3、以宮頸癌疾病為例，檢測IL-18血清水平，臨床評價候選SNP 位點與IL-18血清水平的關系以及對于疾病的意義，從蛋白水平驗證生物信息學篩選策略的有效性。 方法： 1、生物信息學策略篩選宮頸癌相關IL-18基因SNP位點IL-18是一種1996年命名的多功能細胞因子。我們重點研究存在于調(diào)控區(qū)以及編碼區(qū)的SNPs，因為它們直接影響基因的功能和表達水平。由于IL-8調(diào)控區(qū)范圍較大，我們

5、重點研究文獻報道的對IL-18轉(zhuǎn)錄表達明確調(diào)控作用的一段啟動子調(diào)控區(qū)域。使用SNPper軟件從公共數(shù)據(jù)庫dbSNP獲得IL-18調(diào)控區(qū)和編碼區(qū)的SNPs數(shù)據(jù)。對于編碼區(qū)SNPs，先使用同源模型數(shù)據(jù)庫搜索得到IL-18同源序列模塊Blocks，Blocks是在進化過程中非常保守的區(qū)域。然后使用PARSESNP軟件進行篩選和分析編碼區(qū)SNPs是否對基因表達產(chǎn)物產(chǎn)生影響；對于調(diào)控區(qū)SNPs，使用轉(zhuǎn)錄因子結合部位預測軟件分析調(diào)控區(qū)SNPs是否對

6、基因轉(zhuǎn)錄表達水平產(chǎn)生影響。從而確定IL-18基因重要SNP，作為與細胞因子IL-18關系密切的疾病研究的候選多態(tài)性位點。 2、候選IL-18基因SNP 位點與宮頸癌相關性研究通過文獻檢索確定IL-18基因為宮頸癌相關候選研究基因。納入宮頸癌確診患者與正常人作為研究對象，采用病例對照研究方法。采集外周靜脈血，用直接測序法對候選SNP 位點的基因型進行檢測，獲得候選SNP 位點的基因型頻率和等位基因頻率，然后病例組與對照組之間進行統(tǒng)

7、計分析兩者相關性。 3、候選IL-18基因SNP 位點與宮頸癌患者IL-18血清水平相關性研究納入宮頸癌確診患者與正常人作為研究對象。采集外周靜脈血，用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)法檢測血清IL-18含量。然后通過析因設計資料的方差分析，檢驗宮頸癌患病與否以及不同IL-18基因型對IL-18血清濃度變異的主效應與交互效應。 4、統(tǒng)計學方法采用SPSS 10.0專業(yè)版統(tǒng)計分析軟件進行分析。宮頸癌患者組和正常對照

8、組等位基因及基因型分布頻率比較采用x<'2>檢驗。宮頸癌患者組和正常對照組，以及不同基因型組下的血清IL-18平均濃度之間的比較采用析因設計資料的方差分析。檢驗水準a=0.05。 結果： 1、經(jīng)過SNPper軟件分析，共獲得候選啟動子區(qū)5個SNP(rs5744224、rs1946519、rs1946518、rs5744225、rs5744226)，編碼區(qū)2個SNP(coding SNP，cSNP)(rs549908、rs

9、5744290)。通過分析我們發(fā)現(xiàn)IL-18編碼區(qū)的2個SNP位點由于屬于同義SNP，不會影響蛋白功能，所以將2個編碼區(qū)SNP均排除研究之外。將候選的IL-18基因調(diào)控區(qū)DNA序列在兩個在線預測軟件進行潛在的真核轉(zhuǎn)錄因子識別位點的搜索分析。其中TFSEARCH搜索分析表明，Score值等于或大于90.0的轉(zhuǎn)錄因子結合位點共12個，只有rs1946518這個SNP位點存在于轉(zhuǎn)錄因子CdXA(caudal type homeobox tra

10、nscription factor A，尾型同源異型轉(zhuǎn)錄因子A)結合部位；Alibaba2.1軟件搜索分析表明，將矩陣保守性參數(shù)設置在80％以上，則候選DNA序列的轉(zhuǎn)錄因子結合位點共13個，只有rs19446518這個SNP位點存在于轉(zhuǎn)錄因子HNF-1C(hepatic nuclear factor 1-C，肝核轉(zhuǎn)錄因子1-C)結合部位。其他4個SNP位點均未有轉(zhuǎn)錄因子結合。另根據(jù)文獻檢索，rs1946518這個SNP位點還是轉(zhuǎn)錄因子3

11、'，5'-環(huán)單磷酸腺苷(3'，5'-cyclic adenosine monophoshate，cAMP)反應元件結合蛋白結合區(qū)。所以rs1946518很有可能對IL-18的轉(zhuǎn)錄翻譯水平有重大影響。因此我們選定rs1946518這個SNP位點為IL-18基因的重要候選位點。預測此位點可能影響IL-18的轉(zhuǎn)錄表達水平，從而影響機體對疾病的抵抗作用。2、基因直接測序發(fā)現(xiàn)調(diào)控區(qū)5個SNP 中有rs1946519(T/G)、rs1946518(

12、A/C)2個SNP位點呈多態(tài)性并有連鎖關系。rs1946518以三種基因型存在：TT、GG、TG。患者組3種基因型頻率分別為56％(28/50)、10％(5/50)、34％(17/50)，對照組3種基因型頻率分別18％(9/50)、34％(17/50)、48％(17/50)。宮頸癌患者與對照組之間等位基因T、G頻率差異有統(tǒng)計學意義(x<'2>=19.662，P=0.000)；兩組研究對象基因型的分布頻率差異有統(tǒng)計學意義(x<'2>=17

13、.497，P=0.000)。 3、測定了所有研究對象血清IL-18含量，結果顯示宮頸癌患者與正常對照組之間血清IL-18平均濃度比較差異有統(tǒng)計學意義(F=14.445，P=0.000)；按照rs1946518位點rrT、GG、TG三個基因型分為三組，3組的血清IL-18平均濃度差異有統(tǒng)計學意義(F=11.307，P=0.000)；宮頸癌患病與否與不同IL-18基因型之間交互效應顯著(F=4.223，P=0.018)。 對

14、照組中不同IL-18基因型的血清IL-18濃度比較差異沒有統(tǒng)計學意義(F=1.147，P=0.326)。病例組中不同IL-18基因型的血清IL-18濃度比較差異有統(tǒng)計學意義(F=22.445，P=0.000)。進一步用多重比較，TT基因型組的IL-18平均濃度最低，與其它兩組的平均濃度之間差異均有統(tǒng)計學意義(P=0.000)。TG組平均濃度雖然比GG組高，但兩者之間差異沒有統(tǒng)計學意義(P=0.379)。 結論： 1、用生

15、物信息學策略初篩疾病相關SNP位點，雖然可能忽略某些位點，但不失為一種事半功倍的方法，可以大大減少大規(guī)模篩查實驗的操作，從而為進一步探討疾病與某一基因的關聯(lián)性提供很有價值的信息。 2、IL一18基因啟動子區(qū)rs1946518位點多態(tài)性與宮頸癌相關，宮頸癌組T等位基因頻率較高，正常對照組G等位基因頻率較高。 3、IL-18血清濃度變化不但與IL-18基因型有關，而且與宮頸癌發(fā)病過程中的其他因素有關。 4、IL-18

16、基因rs1946518位點多態(tài)性可以影響血清IL-18水平。這可能導致宮頸癌患者的免疫平衡失調(diào)，Th1型反應模式占弱勢狀態(tài)，細胞免疫功能不能有效地激活，機體免疫功能處于抑制狀態(tài)，從而有利于腫瘤的發(fā)生及發(fā)展。這將會為宮頸癌的早期診斷、一級預防等提供線索，并可制定更可靠的治療手段。 研究創(chuàng)新之處： 1、探索建立了一種篩選疾病相關基因的SNP 位點的生物信息學策略并作了臨床評價，為今后開展類似研究做了方法學基礎； 2、