CaMKII可變剪接異構體在β1腎上腺素受體通路的持久興奮導致的心力衰竭中表達、功能及干預機制.pdf

1、研究背景和目的:大量研究表明短期興奮β1腎上腺素受體激活 G(s)–腺苷環(huán)化酶-cAMP-PKA信號通路。然而β1腎上腺素受體長期興奮可心肌細胞肥大和凋亡,而且這些效應與經典的cAMP/PKA通路不同,它表現(xiàn)為PKA的脫敏,轉為對Ca2+/鈣調蛋白依賴的蛋白激酶(CaMKII)的激活。CaMKII尤多異構體,CaMKIIδ是心臟中表達的主要異構體,CaMKIIδ兩個主要剪接異構體δB和δC,它們在心肌肥厚和心力衰竭中可能發(fā)揮不同作用,因

2、此值得深入研究。過度表達δc的轉基因鼠心肌收縮功能明顯下降,理阿諾堿受體2(RyR2)磷酸化增加,心室明顯擴張,最終發(fā)生心力衰竭,提示CaMKIIδ參與心力衰竭發(fā)生發(fā)展過程。研究證明,在壓力超負荷(TAC)的動物心肌中只有δC表達,并且在TAC后7天時仍繼續(xù)升高。還有研究表明,刺激β1-腎上腺素能受體(AR)激活可以激活絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號途徑,從而調節(jié)細胞的多種功能活動。MAPKs家族由一系列蛋白激酶組成,其中三個重要的

3、成員是:細胞外信號調節(jié)激酶( ERK),c-Jun氨基端激酶(JNK)和p38 MAPK。JNK和p38是促進細胞凋亡的蛋白激酶,ERK具有抗細胞凋亡的作用。CaMKII可以活化 p38 MAPK上調促凋亡蛋白Bax和下調抗凋亡蛋白Bcl-2引起心肌細胞凋亡。另有研究證實應激通過p38 MAPK誘導轉錄因子C/EBP同源蛋白(CHOP)、半胱氨酸蛋白酶caspase-12活化及磷酸化刺激內質網(wǎng)應激(ERs)及其相關凋亡基因。那么β1腎上

4、腺素受體持久興奮通過激活 CaMKIIδC導致心肌細胞凋亡的可能機制是什么。MAPKs家族基因和內質網(wǎng)應激信號通路在其中所起的作用是什么?這些均有待研究闡明。我們假設持久興奮β1腎上腺素受體激活可以激活 CaMKIIδC及 MAPKs家族中p38MAPK活化,并進一步引起心肌細胞內質網(wǎng)應激反應以及細胞凋亡,最終導致心力衰竭。為了證明這一假說,我們建立了異丙腎上腺素誘導的心衰模型,同時我們用β1腎上腺素受體阻斷劑美托洛爾干預,來研究CaM

5、KIIδ異構體、MAPKs家族和內質網(wǎng)應激在β1腎上腺素受體持久激活導致心力衰竭發(fā)生、發(fā)展過程的作用。通過本項目研究將能為研究和制定通過干預β1-AR持久激活阻斷心肌損傷的機制研究預防和治療心力衰竭的新的策略和措施提供理論依據(jù)。
　　方法:40只SD大鼠隨機分成四組,正常對照組(Control)、異丙腎上腺組(Iso)、異丙腎上腺+美托洛爾組(Iso+Met)和美托洛爾組(Met),每組10只,所有動物均自由進食進水。(1)異丙腎

6、上腺組(Iso)大鼠背部皮下注射 Iso5mg/(kg/d),連續(xù)10d;對照組背部皮下注射相同體積的生理鹽水;異丙腎上腺+美托洛爾組大鼠背部皮下注射Iso5mg/(kg/d),連續(xù)10d,在背部皮下注射Iso前日開始美托洛爾10mg/(kg/d)連續(xù)4周灌胃;美托洛爾組給予10mg/(kg/d),連續(xù)4周灌胃。(2)所有大鼠飼養(yǎng)4周后,采用美國Millar公司P-V Loop導管經頸動脈插管至左心室,使用Powerlab生理記錄系統(tǒng)測

7、量血流動力學相關指標;(3)酶聯(lián)免疫(ElISA)分析大鼠鈣/鈣調素依賴性蛋白激酶II活性,TUNEL法和Caspase3活性檢測心肌細胞凋亡;(4)為研究CaMKIIδ不同剪接體在心力衰竭發(fā)生、發(fā)展的作用,我們采用人工合成多肽抗原多次免疫法免疫家兔制備 CaMKⅡδB和 C不同剪接體特異性多肽抗體,ElISA法證明抗體滴度,用辛酸-硫酸銨法純化抗體,十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(12％SDS-PAGE)電泳考馬斯藍檢測抗體純度。并經

8、 Western Blot檢測心肌中不同異構體的表達水平。(5)經免疫組化和Western雜交分析檢測MAPKs家族(p-38、 JNK、 ERK)、ERS相關基因(GRP78、CHOP、caspase-12)、細胞生存相關基因 PI3K、Akt和凋亡相關基因Bcl-2/Bax的表達水平和磷酸化水平。
　　結果:40只SD大鼠實驗過程精神狀態(tài)好,進食進水正常,無呼吸困難及水腫。(1)異丙腎上腺素和美托洛爾干預SD大鼠心臟重塑和血流

9、動力學指標有顯著改變,異丙腎上腺素組心臟重量和心臟重量指數(shù)和正常對照組相比有顯著性差異(P<0.05);但異丙腎+美托洛爾組心臟重量和心臟重量指數(shù)明顯低于異丙腎上腺素組(P<0.05);大鼠體重、肝重和肺重四組間也無明顯差異。大鼠血流動力學指標心率(HR)、平均動脈血壓(MBP)和左室舒張末壓(LVEDP)異丙腎上腺素組明顯高于正常對照組;但左室壓力變化速率(LV dp/dt)異丙腎上腺素組明顯低于正常對照組(P<0.05);而異丙腎+

10、美托洛爾組HR、MBP和LVEDP明顯低于異丙腎上腺素組(P<0.05),但異丙腎+美托洛爾組LV dp/dt明顯高于異丙腎上腺素組(P<0.05)。(2)異丙腎上腺素組 SD大鼠心肌細胞 TUNEL陽性細胞數(shù)和 Caspase-3活性明顯高于正常對照組(P<0.05);Western雜交分析檢測異丙腎上腺素組抗凋亡蛋白bcl-2表達明顯低于正常對照組(P<0.05),而促抗凋亡蛋白Bax表達明顯高于正常對照組。CaMKII活性分析結果

11、顯示異丙腎上腺素組明顯高于正常對照組(P<0.05)。說明異丙腎上腺素誘導了明顯的心肌細胞凋亡,并且心肌細胞凋亡和 CaMKII活性明顯正相關。(3)我們采用人工合成多肽抗原多次免疫法免疫家兔制備CaMKⅡδB和C不同剪接體特異性多肽抗體, ELISA證明抗體滴度均達到12800以上,12%SDS-PAGE)電泳考馬斯藍檢測抗體純度好。(4)CaMKIIδ異構體、MAPKs家族和ERs相關基因在β1腎上腺素受體持久興奮的SD大鼠心肌表達

12、情況,我們用Western blot方法分析結果顯示異丙腎上腺素組CaMKIIδC和p-CaMKIIδ、p38 MAPK、JNK、GRP78、CHOP和Cleaved caspase-12蛋白表達明顯高于正常對照組(P<0.05),但β1腎上腺素受體阻滯劑美托洛爾可阻斷上述過程。而異丙腎上腺素組ERK和PI3K/Akt蛋白表達明顯低于正常對照組(P<0.05)。
　　結論:(1)β1腎上腺素受體持久興奮激活CaMKIIδ通路,Ca

13、MKIIδC剪接異構體是β1腎上腺素受體信號通路持久激活誘導心肌細胞凋亡的主要成分。(2)β1腎上腺素受體通路持久興奮激活CaMKIIδ通路和MAPKs家族信號分子,并進一步誘導ER應激,促進凋亡,最終導致心肌重構、心力衰竭。(3)β受體阻滯劑美托洛爾可阻斷β1腎上腺素受體持久激活-CaMKIIδ-MAPKs-ER應激-細胞凋亡途徑,對心臟有保護效應。(4)針對CaMKIIδC的干預β1腎上腺素受體持久興奮阻斷心肌損傷的機制研究為預防和