簡易型微流控芯片的研制及其在臨床診斷中的應(yīng)用.pdf

1、研究目的：
　　針對微流控芯片光刻制作工藝中存在的過程繁瑣,實驗條件要求高、設(shè)備成本高等問題,本研究采用激光雕刻機在雙面粘性薄膜上雕刻流體通道,以聚二甲基硅氧烷(PDMS)為蓋片、雙面粘性薄膜(DSA)為流體通道層、玻璃為基片,以研制一種低成本、易制作、便攜式的 PDMS-DSA微流控芯片,并應(yīng)用于循環(huán)腫瘤細胞的捕獲富集及食品中大腸埃希菌 O157:H7的檢測。
　　研究方法：
　　1、研制簡易型微流控芯片檢測系統(tǒng):<

2、br>　　采用計算機輔助軟件(Pro/Engineer5.0, ProE5.0)設(shè)計簡易型微流控芯片CAD圖形,采用激光雕刻技術(shù)在雙面粘性薄膜上按照設(shè)計圖形切出流體通道,再將激光雕刻后的雙面粘性薄膜與 PDMS及玻片封接制成 PDMS-DSA微流控芯片,將制備好的微流控芯片與注射泵、注射器、熒光倒置顯微鏡和 CCD等設(shè)備連接,建立自動化的簡易型微流控芯片反應(yīng)系統(tǒng)。
　　2、簡易型微流控芯片的表面修飾和抗體固定方法的優(yōu)化:
　

3、　以巰基-馬來酰亞胺基團硅烷化偶聯(lián)法為芯片的表面修飾方法,以鏈霉親和素-生物素親合法為芯片的抗體固定方法,通過比較不同反應(yīng)時間、進樣流速等實驗參數(shù),優(yōu)化出簡易型微流控芯片中抗體的最佳反應(yīng)條件。
　　3、簡易型微流控芯片在循環(huán)腫瘤細胞捕獲富集中的應(yīng)用:
　　以簡易型微流控芯片檢測系統(tǒng)為平臺,以乳腺腫瘤細胞(ATCC MCF-7和MDAMB231腫瘤細胞)為研究對象,在最佳抗體固定條件下,通過比較不同進樣流速、抗體濃度及反應(yīng)時間

4、,建立基于簡易型微流控芯片的循環(huán)腫瘤細胞捕獲富集方法,并將此方法應(yīng)用于模擬腫瘤患者外周血樣本的檢測。
　　4、簡易型微流控芯片在大腸埃希菌 O157:H7檢測中的應(yīng)用:
　　以簡易型微流控芯片檢測系統(tǒng)為平臺,以最佳抗體固定參數(shù)固定抗體,在此基礎(chǔ)上,以免疫熒光技術(shù)為檢測手段,優(yōu)化最佳進樣流速、檢測時間,建立基于簡易型微流控芯片大腸埃希菌 O157:H7檢測方法,并將此方法應(yīng)用于牛奶及飲用水模擬污染樣本中大腸埃希菌 O157:H

5、7的檢測。
　　研究結(jié)果：
　　1、使用激光雕刻機可在1分鐘內(nèi)同時雕刻8-10個雙面粘性薄膜,并在1分鐘完成簡易型微流控芯片的制作,整個制作過程中無需使用超凈間、光刻機和有機溶劑。以此芯片與熒光倒置顯微鏡檢測器和 CCD連接,成功搭建了低成本、自動化的簡易型微流控芯片檢測系統(tǒng)。
　　2、在進樣流速為2μl/min時,未經(jīng)表面修飾直接通入生物素標記的 EpCAM抗體的芯片對 MCF-7腫瘤細胞的捕獲率為3％,而經(jīng)過表面修

6、飾再通入生物素標記的 EpCAM抗體的芯片對 MCF-7腫瘤細胞的捕獲效果明顯更高,為(92±3)%。
　　3、在 EpCAM抗體濃度為10mg/ml,反應(yīng)時間為1h,進樣流速分別為2μl/min、4μl/min、6μl/min和8μl/min時,基于簡易型微流控芯片系統(tǒng)對 MCF-7腫瘤細胞的捕獲率分別為(92±3)%、(60±2)%、(24±2)%和(10±2)%,對 MDAMB231腫瘤細胞的捕獲率分別為(75±3)%、(5

7、2±2)%、(20±3)%和(7±2)%?？梢?兩種腫瘤細胞在進樣流速為2μl/min時捕獲率最高。將此方法應(yīng)用于模擬腫瘤患者外周血樣本的檢測,在進樣流速為2μl/min、4μl/min、6μl/min和8μl/min時,基于簡易型微流控芯片系統(tǒng)對腫瘤細胞的捕獲率分別為(88±3)%、(50±2)%、(17±3)%和(5±2)%。
　　4、在抗大腸桿菌 O157:H7 FITC標記抗體濃度為50mg/ml,反應(yīng)時間為30min,雙

8、面粘性薄膜厚度為25μm,進樣流速為2μl/min,總檢測量為60μl,總檢測時間為30min時,基于簡易型微流芯片系統(tǒng)對大腸埃希菌O157:H7捕獲率為(95±2)%,與大腸埃希菌 ATCC25922和傷寒沙門菌無交叉反應(yīng)。將此方法應(yīng)用于牛奶和飲用水模擬樣本大腸埃希菌 O157:H7的檢測,靈敏度分別為86%和93%,特異度均為100%。
　　結(jié)論：
　　1、基于激光雕刻技術(shù)的簡易型微流控芯片制作工藝具有流程簡單,對實驗儀

9、器要求低,成本低,低碳環(huán)保等優(yōu)點,彌補了傳統(tǒng)光刻工藝復(fù)雜繁瑣的不足?；诤喴仔臀⒘骺匦酒瑱z測系統(tǒng)可實現(xiàn)自動化、智能化的流體操作。
　　2、在最佳反應(yīng)條件下,經(jīng)過巰基-馬來酰亞胺基團硅烷化偶聯(lián)法進行表面修飾的簡易型微流控芯片對細胞的捕獲率比未經(jīng)表面修飾的簡易型微流控芯片捕獲率高。
　　3、以簡易型微流控芯片檢測系統(tǒng)捕獲循環(huán)腫瘤細胞,進樣流速為2μl/min時的細胞捕獲率明顯比8μl/min時高,且隨著流體速度的不斷加快,細胞的