用四種體外試驗方法評價長春新鹼誘發(fā)的人淋巴細胞的遺傳損傷.pdf

1、1.目的：抗腫瘤藥物是通過殺死增生細胞和破壞細胞分裂來阻止腫瘤生長的化學物,然而,許多抗腫瘤藥物在動物實驗和體外實驗證明具有致癌性、致突變性和致畸性。目前檢測細胞遺傳損傷的方法很多,常用的有染色體畸變、姐妹染色單體交換(SCE)、微核試驗(MN)、彗星試驗和基因突變試驗等方法。長春新鹼(VCR)是一種抗有絲分裂的抗腫瘤藥物,并被IARC列為10種對人致癌的抗癌藥物中的一種(IARC,1987,1990)。長春新鹼系紡錘體毒物,能影響有絲

2、分裂和減數(shù)分裂,誘發(fā)染色體多倍體、染色體畸變和微核,而且低劑量VCR還具有致畸作用。為了研究VCR引起遺傳損傷的特點,本實驗通過4個體外試驗即胞質分裂阻斷微核試驗(染色體損傷)、hprt基因突變試驗和TCR基因突變試驗(基因突變)和彗星試驗(DNA損傷)從不同遺傳終點來評價人外周血淋巴細胞暴露于不同劑量長春新鹼(VCR)后所誘發(fā)的遺傳損傷。
　　2.材料與方法：
　　2.1.樣本肝素化的外周血采自男女兩名,25歲,無有毒有害

3、物質職業(yè)接觸史健康的助血員。樣本VCR暴露最終濃度為0.00、0.01、0.02、0.04、0.08μg ml-1,暴露24h后用PBS清洗兩次。
　　2.2.方法彗星試驗:分離淋巴細胞,調整細胞密度并用臺盼藍染色計數(shù)細胞存活率,經(jīng)制片、細胞裂解、電泳、中和、染色等步驟后在熒光顯微鏡(OLYMPUS-BX51)下觀察。測量彗星圖像指標是彗星尾長和尾相。胞質分裂阻斷微核試驗:將全血于1640培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)44h,加入細胞松弛素B

4、,繼續(xù)培養(yǎng)28h后收獲細胞,經(jīng)離心、低滲、固定、制片、自然干燥后吉姆塞染色。高倍鏡下計數(shù)1000個雙核細胞,以微核率(MNR)、微核細胞率(MCR)、核芽(Buds)、核質橋(NPBs)、和凋亡細胞(apoptotic cells)作為細胞毒性和染色體損傷指標。另計數(shù)500個細胞,計算核分裂指數(shù)(NDI)。hprt基因突變試驗:基本方法與微核實驗同。其中一份培養(yǎng)基加入0.2mM的6-巰基鳥嘌呤(Sigma)。37℃,叵溫箱中培養(yǎng)72h。

5、制片后在400倍光學顯微鏡下觀測同一胞漿內具有完整核膜的相壓、相切或分離的雙核或多核的淋巴細胞數(shù),計算hprt基因突變率。TCR基因突變試驗:分離淋巴細胞,用臺盼藍試驗檢測細胞存活率并計數(shù)細胞數(shù)目。加入抗人CD4-fluorescein isothiocyanate(FITC)和CD3-phycoerythrin(PE)單克隆抗體(BD Biosciences),避光冰上孵育30分鐘。TCR突變CD3-CD4+T細胞通過流式細胞儀檢測,

6、計算TCR基因突變率。
　　3.結果實驗結果表明可用彗星試驗,微核試驗,hprt基因突變試驗和TCR基因突變試驗四個體外試驗檢測出長春新鹼誘導的人淋巴細胞的遺傳損傷。(1)彗星試驗助血員1:染毒劑量從0.01μg ml-1到0.08μg ml-1時,助血員1的平均尾長(MTL)和尾相(MTM)分別從1.87±0.09μm和0.77±0.04增至4.44±0.28μm和2.22±0.21,與對照組的1.14±0.03μm和0.51±

7、0.01相比較,差異明顯(P＜0.05或P＜0.01)。助血員2:染毒劑量從0.01μg ml-1到0.08μg ml-1時,助血員2的平均尾長(MTL)和尾相(MTM)分別從1.76±0.07μm和0.65±0.03增至4.05±0.18μm和1.86±0.10,與對照組的1.08±0.04μm和0.49±0.02相比較,差異明顯(P＜0.05或P＜0.01)。(2)微核試驗助血員1的結果發(fā)現(xiàn),染毒劑量從0.01μg ml-1到0.0

8、8μg ml-1時,微核率、微核細胞率、核芽、核質橋和核分裂指數(shù)(減少)分別從16.00±2.52、13.00±1.00、6.33±0.33、1.33±0.33、1.82±0.04增加(減少)到67.00±1.15、47.33±3.53、14.00±1.53、4.67±0.43、1.44±0.02,與對照組的2.00±0.58、2.00±0.58、0.00±0.0、00.00±0.00、2.34±0.01相比,有明顯差異(P＜0.05或

9、P＜0.01)。染毒劑量從0.01μg ml-1到0.08μg ml-1時,凋亡細胞數(shù)從0.67±0.33增至17.33±1.20。染毒劑量0.02μg ml-1時,凋亡細胞數(shù)為2.67±0.67,從該劑量開始與對照組相比出現(xiàn)明顯差異(P＜0.05或P＜0.01)。助血員2的結果發(fā)現(xiàn),染毒劑量從0.01μg ml-1到0.08μg ml-1時,微核率、微核細胞率、核芽、核質橋和核分裂指數(shù)(減少)分別從19.00±2.65、17.00±2

10、.08、5.33±0.33、1.67±0.67、1.83±0.05增加(減少)到74.67±1.33、60.00±0.58、17.00±1.53、5.00±0.58、1.44±0.02,與對照組的6.00±1.53、5.67±1.20、1.67±0.33、0.00±0.00、0.00±0.00、2.27±0.01相比,有明顯差異(P＜0.05或P＜0.01)。染毒劑量從0.01μg ml-1到0.08μg ml-1時,凋亡細胞數(shù)從0.3

11、3±0.33增至12.67±0.88。染毒劑量0.02μgml-1時,凋亡細胞數(shù)為3.33±0.33,從該劑量開始與對照組相比出現(xiàn)明顯差異(P＜0.05或P＜0.01)。(3)hprt基因突變試驗結果:當染毒劑量從0.01μg ml-1到0.08μg ml-1時,助血員1 Mf-hprt從0.96±0.03‰增至1.44±0.08‰,并從0.02μg ml-1劑量組(1.01±0.04)開始與對照組(0.85±0.02)相比出現(xiàn)明顯差異

12、(P＜0.05或P＜0.01)。助血員2組當染毒劑量從0.01μg ml-1到0.08μg ml-1時,Mf-hprt從0.96±0.02‰增至1.47±0.12‰,并從0.02μg ml-1劑量組(1.01±0.04)開始與對照組(0.85±0.02)相比出現(xiàn)明顯差異(P＜0.05或P＜0.01)。(4)在TCR基因突變試驗中,當染毒劑量從0.01μg ml-1到0.08μg ml-1時,助血員1 Mf-TCR從2.65±0.34×1

13、0-4增至7.68±1.13×10-4,并從0.04μg ml-1劑量組(5.78±0.67×10-4)開始與對照組(1.97±0.12×10-4)相比出現(xiàn)明顯差異(P＜0.01)。助血員2組當染毒劑量從0.01μg ml-1到0.08μg ml-1時,Mf-TCR從3.6±0.65×10-4增至6.51±0.30×10-4,并從0.02μg ml-1劑量組(4.15±0.67×10-4)開始與對照組(2.46±0.41×10-4)相比