基于原子力顯微鏡技術(shù)在單細(xì)胞水平研究殼聚糖-膠原的細(xì)胞相容性.pdf

1、細(xì)胞膜表面的粘附受體分子對細(xì)胞感知和集成細(xì)胞周圍微環(huán)境所提供的信號(hào),例如基底表面物理化學(xué)性質(zhì)和基底硬度等至關(guān)重要，細(xì)胞將所感知的化學(xué)信號(hào)或力信號(hào)轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的生物信號(hào)，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞粘附、鋪展、增殖和分化等生理過程。定量地檢測細(xì)胞與生物材料基底間相互作用，了解基底對細(xì)胞生理行為的影響，不僅對揭示細(xì)胞生理行為變化的本質(zhì)具有十分重要的意義，同時(shí)也可以為生物材料的設(shè)計(jì)提供重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。近年來，隨著原子力顯微鏡（AFM）技術(shù)在生物學(xué)方面應(yīng)用的不斷

2、拓展，能夠在單細(xì)胞水平上揭示生物材料與細(xì)胞間的相互作用，為定量研究細(xì)胞的生理變化和生物材料的設(shè)計(jì)提供了重要的微觀信息和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。因此，本文以AFM單細(xì)胞力譜技術(shù)為主要技術(shù)手段，殼聚糖和膠原為研究模型，在單細(xì)胞水平上評(píng)價(jià)殼聚糖/膠原基底的細(xì)胞相容性及其作用機(jī)制，主要從以下三個(gè)方面展開研究：
　　1、目前，AFM用于檢測細(xì)胞楊氏模量的技術(shù)還不是十分成熟，許多操作參數(shù)需要深入研究，以獲得準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。首先，我們通過AFM納米操作技術(shù)，

3、將直徑為5μm的二氧化硅微球修飾在無針尖的AFM探針懸臂上，用于檢測細(xì)胞和基底的力學(xué)性能。這一以AFM納米操作技術(shù)為基礎(chǔ)的探針修飾方法的成功為進(jìn)一步將活細(xì)胞固定于AFM探針上，建立AFM單細(xì)胞力譜技術(shù)奠定了基礎(chǔ)。同時(shí)，我們系統(tǒng)地研究了在細(xì)胞楊氏模量測量過程中，AFM施加的探針壓痕力和加載速度以及探針形狀對細(xì)胞楊氏模量測量結(jié)果的影響，為AFM測量細(xì)胞楊氏模量的參數(shù)選擇提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。此外，我們通過AFM檢測在相同基底上培養(yǎng)的不同細(xì)胞

4、，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同的細(xì)胞展現(xiàn)出不同的楊氏模量，證實(shí)AFM可以作為一種用于疾病診斷或細(xì)胞生理狀態(tài)表征的新方法。
　　2、基于AFM研究不同組分殼聚糖-膠原膜對細(xì)胞粘附、形貌和力學(xué)性能的影響。利用AFM單細(xì)胞力譜技術(shù)，定量檢測了細(xì)胞與不同基底間的相互作用力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著膜中膠原含量的增加，細(xì)胞的粘附力從0.76±017 nN增加到1.70±0.19 nN，細(xì)胞的楊氏模量從11.94±3.19 kPa減小至1.81±0.52 kPa；

5、細(xì)胞鋪展面積和增殖速率逐漸增加，細(xì)胞高度逐漸降低，偽足融合，細(xì)胞邊緣變平滑。結(jié)果表明在基底上較大的細(xì)胞粘附力和較小的細(xì)胞楊氏模量會(huì)促進(jìn)細(xì)胞的粘附、鋪展，使細(xì)胞在不同膜上展出明顯的形貌差異；實(shí)驗(yàn)結(jié)果也得到了細(xì)胞光學(xué)顯微鏡周長及面積統(tǒng)計(jì)和CCK-8實(shí)驗(yàn)的佐證。這一研究為生物材料的設(shè)計(jì)和殼聚糖-膠原基細(xì)胞靶向藥物載體的設(shè)計(jì)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論指導(dǎo)。
　　3、基于 AFM力譜技術(shù)，通過制備不同硬度的殼聚糖膜，研究基底硬度對細(xì)胞粘附和鋪展的

6、影響。首先，將MC3T3-E1細(xì)胞修飾在無針尖的AFM探針上，檢測細(xì)胞與不同硬度基底間的粘附力，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，細(xì)胞的粘附力隨著基底硬度的增加而增加，在較軟的殼聚糖膜上細(xì)胞的粘附力最小，為0.53±0.08 nN，在較硬的殼聚糖膜上，細(xì)胞的粘附力最大為1.19±0.14 nN；進(jìn)一步對不同硬度膜上細(xì)胞的楊氏模量統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，隨著基底硬度的增加，細(xì)胞楊氏模量從12.6±2.3 kPa減小到3.6±1.5 kPa；在相同硬度的殼聚糖膜上，吸附

7、膠原后，細(xì)胞的粘附力發(fā)生了相應(yīng)的增加，細(xì)胞楊氏模量發(fā)生降低，證實(shí)膠原可以增強(qiáng)材料的細(xì)胞親和力。此外，細(xì)胞鋪展面積和細(xì)胞AFM微觀形貌的檢測結(jié)果表明，隨著基底硬度的增加，細(xì)胞的鋪展面積增加，細(xì)胞偽足逐漸融合；CCK-8實(shí)驗(yàn)證實(shí)基底硬度的增加促進(jìn)了MC3T3-E1細(xì)胞的增殖和粘附。我們的實(shí)驗(yàn)在單細(xì)胞水平上，證實(shí)細(xì)胞粘附力和楊氏模量的變化是基底硬度對細(xì)胞粘附、鋪展影響的主要因素，同時(shí)也證實(shí)基底的微觀硬度也是影響材料細(xì)胞相容性的主要因素，這為復(fù)