Fruitless在家蠶求偶行為中的功能研究.pdf

1、求偶行為是動物交配的必需步驟，對動物的繁衍有著重要意義。fruitless是昆蟲求偶行為中的關(guān)鍵基因。在模式昆蟲果蠅中，fruitless主要通過調(diào)控與求偶相關(guān)的神經(jīng)元形態(tài)和數(shù)量，從而促使雄性果蠅進(jìn)行求偶行為。家蠶作為一種重要的鱗翅目模式昆蟲，關(guān)于fruitless基因研究未見報(bào)道。
　　本研究選取了家蠶fruitless基因作為研究對象。首先，對fruitless進(jìn)行了克隆，序列比對和信息分析，利用RT-PCR分析了其組織和時(shí)期

2、表達(dá)特征。通過原核表達(dá)獲得了fruitless的重組蛋白，進(jìn)一步制備了fruitless的多克隆抗體，然后利用多克隆抗體檢測了fruitless在家蠶體內(nèi)的存在形式，同時(shí)進(jìn)行了亞細(xì)胞定位和組織定位；還利用了RNA干涉技術(shù)，對家蠶個(gè)體進(jìn)行了干涉實(shí)驗(yàn)；最后利用免疫沉淀技術(shù)，獲得一些潛在的與fruitless相結(jié)合的蛋白。主要結(jié)果如下：
　　1、家蠶fruitless的克隆、序列分析和表達(dá)譜；
　　本研究將果蠅Fruitless蛋

3、白質(zhì)序列在家蠶數(shù)據(jù)庫SilkDB上進(jìn)行同源檢索，結(jié)果發(fā)現(xiàn)編號為BGIBMGA006492-TA的預(yù)測基因，其定位于家蠶的第6號染色體上。根據(jù)預(yù)測基因序列設(shè)計(jì)引物，以家蠶成蟲頭部cDNA為模板進(jìn)行基因進(jìn)行克隆，結(jié)果顯示，fruitless基因在家蠶中有兩種剪切形式，第一種剪切形式含7個(gè)外顯子，共927 bp；第二種剪切形式含4個(gè)外顯子，共330 bp（第二種剪切形式在330 bp處，含有終止密碼子）。結(jié)構(gòu)域預(yù)測結(jié)果顯示fruitless基

4、因編碼蛋白質(zhì)是含有一個(gè)BTB結(jié)構(gòu)域和兩個(gè)zinc finger結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)。表明fruitless可能作為轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮作用。RT-PCR結(jié)果表明，兩種剪接形式在雌雄家蠶的各種組織和蛹期中均有表達(dá)。
　　2、家蠶fruitless的原核表達(dá)和抗體制備；
　　通過對fruitless的序列分析，設(shè)計(jì)了表達(dá)引物，將目的片段亞克隆到pET-28a載體上，測序成功后轉(zhuǎn)化到表達(dá)菌株Transetta（DE3）內(nèi)，表達(dá)檢測發(fā)現(xiàn)fruit

5、less的兩種剪接形式均以包涵體形式表達(dá)。于是進(jìn)行了蛋白純化，得到較高純度的蛋白，送到公司制備得到fruitless的多克隆抗體?？贵w特異性檢測結(jié)果顯示，制備的多克隆抗體特異性良好。
　　3、家蠶fruitless的蛋白水平的時(shí)空表達(dá)分析；
　　利用制備的多克隆抗體，檢測到fruitless在家蠶的各個(gè)組織中均有表達(dá)。而在蛹期fruitless的表達(dá)有逐漸增加的趨勢。對fruitless蛋白質(zhì)在細(xì)胞中的表達(dá)進(jìn)行了定位，發(fā)現(xiàn)f

6、ruitless在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)。根據(jù)fruitless的結(jié)構(gòu)域分析，推測其在個(gè)體水平上可能是通過與一些轉(zhuǎn)運(yùn)因子等的結(jié)合，轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核中進(jìn)而參與了基因的調(diào)控，從而發(fā)揮作用。同時(shí)也對fruitless在家蠶幼蟲的腦中進(jìn)行了組織定位，發(fā)現(xiàn)其主要分布在腦部神經(jīng)元的周圍，和左右兩小腦的中間部位的有較高量的表達(dá)。
　　4、家蠶fruitless的功能探究；
　　根據(jù)家蠶fruitless序列合成雙鏈RNA，在蛹期對家蠶進(jìn)行干涉，同時(shí)，利

7、用定量PCR和Western blot實(shí)驗(yàn)對干涉效果進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示個(gè)體中fruitless基因下調(diào)。通過觀察干涉組家蠶和對照組家蠶的求偶行為，發(fā)現(xiàn)干涉后的一部分家蠶未能完成交配（在60 min內(nèi)），而完成交配的家蠶其求偶的時(shí)間大多超過10 min。干涉后的家蠶求偶的時(shí)間延遲，交配率降低。這些結(jié)果說明fruitless在家蠶的求偶行為中發(fā)揮著重要作用。
　　5、家蠶Fruitless相互結(jié)合蛋白的篩選。
　　通過免疫沉淀實(shí)

8、驗(yàn)，找到與對照組差異的蛋白條帶。進(jìn)一步對差異條帶進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，共鑒定出127組，包括327種蛋白。主要分為了4類蛋白，第一類是與神經(jīng)相關(guān)的蛋白，第二類是與細(xì)胞周期相關(guān)蛋白，第三類是與卵的形成相關(guān)蛋白，第四類是功能未知的蛋白。其中，erine/arginine repetitive matrix protein2，pheromone biosynthesis activating neuropeptide receptor，是與神經(jīng)相關(guān)的