Microtox及TTC-DHA在急性毒性檢測中的應(yīng)用研究.pdf

1、微生物因具備生長速度快、繁埴周期短、操作運(yùn)轉(zhuǎn)費(fèi)用低及不存在倫理學(xué)爭議等諸多優(yōu)點(diǎn),而被廣泛應(yīng)用為環(huán)境樣品初篩評價(jià)試驗(yàn)的載體,從而與傳統(tǒng)的化學(xué)分析手段及動物實(shí)驗(yàn)方法互為補(bǔ)充。其中基于細(xì)菌生物發(fā)光的毒性分析方法Microtox技術(shù)和借助人工受氫體的細(xì)菌脫氫酶活性檢測技術(shù)(2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride-dehydrogenase activity,TTC-DHA)在國內(nèi)外的應(yīng)用最為廣泛。目前,國內(nèi)尚未深

2、入對這兩種方法進(jìn)行綜合性對比的研究,也沒有進(jìn)一步提高其靈敏度的有效方法。本研究通過探索改善受試細(xì)胞的通透性,來提高細(xì)菌急性毒性檢測方法的靈敏度,并對這兩種方法進(jìn)行同步對比分析。
　　第一部分：通透性改善和微孔板技術(shù)在Microtox檢測中的應(yīng)用
　　目的：通過改善明亮發(fā)光桿菌菌體細(xì)胞的通透性,來提高M(jìn)icrotox方法毒性檢測的靈敏度,并通過使用微孔板來提高檢測效率,以期對傳統(tǒng)的發(fā)光細(xì)菌急性毒性檢測試驗(yàn)的方法進(jìn)行改進(jìn)。

3、>　　方法：以乙二胺四乙酸二鈉(Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt,EDTA-Na2)處理明亮發(fā)光桿菌,用疏水性熒光探針N-苯基-1-萘胺(N-Phenyl-1-naphthylamine,NPN)來檢測其對發(fā)光桿菌細(xì)胞外膜通透性的改變。以全黑96孔板為反應(yīng)板,應(yīng)用發(fā)光細(xì)菌急性毒性檢測技術(shù)(Microtox)來監(jiān)測供試毒物在EDTA加入前后的50％發(fā)光抑制濃度值(Effective

4、 concentration,EC50)。
　　結(jié)果：1.相對于不加EDTA的檢測系列,40mmol/L的EDTA能使明亮發(fā)光桿菌對NPN熒光吸收的改變最大,NPN吸收系數(shù)由8.8增加到13.0,增幅為47.7%。
　　2.經(jīng)擬合分析,16種毒物對細(xì)菌發(fā)光抑制效應(yīng)的相關(guān)度均在96%以上。金屬毒物中的Cu2+、Hg2+和Pb2+在40mmol/LEDTA加入后的EC50值分別有16.93%、14.29%和2.05%的增加,Zn

5、2+的EC50值有4.97%的降低。以EC50值為毒性評價(jià)標(biāo)準(zhǔn),4種重金屬毒物毒性順序?yàn)镠g2+>Pb2+>Zn2+>Cu2+。
　　3.12種有機(jī)毒物在加入40mmol/L的EDTA后均有EC50值的顯著減小,壬基酚的減小幅度最大,為85.83%;其次是1,10-菲啰啉,減小幅度為27.30%;EC50值減小幅度最小的是α-萘胺,為6.47%。以EC50值為標(biāo)準(zhǔn)的12種有機(jī)毒物在通透性改變前的毒性順序?yàn)?-異丙基苯酚>1,4-對

6、苯醌>1-萘酚>二苯胍>雙酚A>萘>α-萘胺>4,4’-二氨基聯(lián)苯>甲苯>1,10-二氮雜菲>聯(lián)苯>壬基酚,用40mmol/L的EDTA增加通透性后,壬基酚的毒性高于聯(lián)苯,其他毒物的順序不變。
　　4.較傳統(tǒng)的Microtox檢測法,使用96孔反應(yīng)板可以減少90%的試劑使用量,節(jié)約95.8%的檢測時(shí)間,且使用黑色96板不需對受試樣品的顏色進(jìn)行校正。
　　結(jié)論：1.EDTA可以提高明亮發(fā)光桿菌對有機(jī)化合物的通透能力,能使Mic

7、rotox方法對有機(jī)物毒性檢測的靈敏度提高。
　　2.與傳統(tǒng)方法相比,使用微孔板的高通量檢測法具備試劑用量少,操作簡便及檢測效率高的優(yōu)點(diǎn)。
　　第二部分：通透性改善技術(shù)在TTC-DHA毒性檢測試驗(yàn)中的應(yīng)用
　　目的：改善銅綠假單胞菌的細(xì)胞通透性,提高2,3,5—氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride,TTC)-脫氫酶活性檢測試驗(yàn)對毒物毒性檢測的靈敏度,并與第一部分Mic

8、rotox方法的試驗(yàn)數(shù)據(jù)比較,分析兩種方法的優(yōu)缺點(diǎn)。
　　方法：以EDTA處理銅綠假單胞菌,用NPN來檢測其對受試菌細(xì)胞外膜通透性改變的能力,應(yīng)用銅綠假單胞菌脫氫酶活性(dehydrogenase activity,DHA)檢測技術(shù)來監(jiān)測供試物在細(xì)胞通透性改變前后的50%效應(yīng)濃度值(EC50)。
　　結(jié)果：1.在PH8.4Tris-HCl緩沖溶液的環(huán)境中,1.4mmol/L的EDTA能使銅綠假單胞菌對NPN熒光吸收的改變最顯

9、著,NPN吸收系數(shù)由6.5增加到9.6,增幅為47.6%。
　　2.8種供試毒物對銅綠假單胞菌脫氫酶活性抑制效應(yīng)的相關(guān)系數(shù)均>0.97。金屬Hg2+在EDTA加入后的EC50值增加了15.29%,而Pb2+的EC50值減小了0.75%,且Hg2+的毒性較大,與Microtox法的試驗(yàn)結(jié)果一致。
　　3.6種供試有機(jī)物在加入1.4mmol/L的EDTA后均有EC50值減小。其中α-萘胺的EC50值僅有0.02%改變,其他毒物的

10、EC50值的改變均在9.19%-17.20之間。6種有機(jī)毒物在1.4mmol/LEDTA加入前后的毒性順序均為4-異丙基苯酚>1,4-對苯醌>雙酚A>α-萘胺>甲苯>4,4’-二氨基聯(lián)苯。與Microtox法的試驗(yàn)結(jié)果相比,僅在甲苯與4,4’-二氨基聯(lián)苯之間有毒性順序的不同。
　　4.Microtox檢測法對4-異丙基苯酚、1,4-對苯醌、雙酚A、α-萘胺和4,4’-二氨基聯(lián)苯的檢測靈敏度較高,而TTC-DHA法對Hg2+、Pb2