cdh5基因在HoxB4特異性高表達(dá)轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)胚胎期造血發(fā)育中的表達(dá)及作用的初步研究.pdf

1、目的：本實(shí)驗(yàn)選擇cdh5為目的基因,觀察cdh5基因在過(guò)表達(dá)HoxB4基因的特異性轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)系胚胎期造血發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)情況,以探討cdh5基因與HoxB4基因調(diào)控造血發(fā)育可能的作用機(jī)制。
　　方法：收集0.75-120hpf之間多個(gè)時(shí)相的野生型斑馬魚(yú)胚胎,TRIZOL法提取總RNA后,通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增cdh5基因片段,將目的片段與載體pCS2+連接,構(gòu)建cdh5-pCS2+重組質(zhì)粒,以T7RNA聚合酶體外轉(zhuǎn)錄制備反義mRN

2、A探針,通過(guò)斑馬魚(yú)全胚胎原位雜交技術(shù)及灰度分析檢測(cè)cdh5基因在野生型斑馬魚(yú)胚胎早期發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)情況,以及在HoxB4實(shí)驗(yàn)組(TG:zLmo2-LDeL-HoxB4-EGFP;TG:zLmo2-Cre)及EGFP對(duì)照組(TG:zLmo2-LDeL-EGFP;TG:zLmo2-Cre)斑馬魚(yú)胚胎早期發(fā)育過(guò)程中表達(dá)變化情況。
　　結(jié)果：成功構(gòu)建了cdh5-pCS2+重組質(zhì)粒,制備了反義mRNA探針,原位雜交結(jié)果示野生型斑馬魚(yú)3.7

3、hpf的胚胎即有cdh5基因的陽(yáng)性雜交信號(hào),而18至36hpf的胚胎cdh5基因在造血組織中間細(xì)胞群(ICM)、主動(dòng)脈-性腺-中腎區(qū)(AGM)、后部血島(PBI)、軀干大血管的血管內(nèi)皮細(xì)胞及腦部組織中表達(dá),30hpf達(dá)到高峰,至36hpf明顯下降。48至72hpf僅在腦部有少量表達(dá),主要的造血部位未觀察到明顯的陽(yáng)性雜交信號(hào)。HoxB4實(shí)驗(yàn)組、EGFP實(shí)驗(yàn)對(duì)照組及野生型對(duì)照組胚胎中,18-40hpf均可觀察到實(shí)驗(yàn)組cdh5基因在造血組織中

4、的表達(dá)均較對(duì)照組明顯增多,即過(guò)表達(dá)HoxB4基因時(shí),cdh5基因的表達(dá)也是增加的。44hpf以后cdh5基因在造血組織中的表達(dá)差異不明顯。
　　結(jié)論：初步了解cdh5基因在野生型斑馬魚(yú)胚胎早期發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)HoxB4的轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)胚胎在造血干細(xì)胞增殖明顯的情況下,cdh5基因的表達(dá)量明顯增加,并且這種表達(dá)增加只發(fā)生在原始及定向造血期,定向造血后其表達(dá)逐漸下降至消失,提示cdh5基因可能作為HoxB4的協(xié)同或下游靶