TGF-β1在BMSC移植可能對大鼠肝纖維及肝癌進程影響中的作用.pdf

1、目的：建立骨髓間充質(zhì)干細胞體外培養(yǎng)及擴增體系的基礎上，探討不同時期移植BMSC、移植時間長短以及移植途徑不同對大鼠肝纖維化進程的影響；從TGF-β1的角度出發(fā)，探討B(tài)MSC移植在肝纖維化進程中的作用機制以及可能在肝硬化后肝癌發(fā)生中的影響。 方法：1、應用密度梯度離心結(jié)合貼壁培養(yǎng)法分離純化雄性SD大鼠BMSC，分別向成骨細胞，成脂肪細胞誘導分化進行鑒定。2、在四氯化碳誘導大鼠肝纖維化模型的第六周、第八周，將來自雄性SD大鼠的BMS

2、C以5×106/只的劑量經(jīng)尾靜脈注入同種雌性大鼠體內(nèi)。分別在BMSC移植4周及6周后處死各組大鼠，評價干預組與對照組的生存狀態(tài)，并用Scheuer炎癥活動度評分法和SchmidM纖維化評分法評價肝臟病理情況。3、在四氯化碳誘導大鼠肝纖維化模型的第六周，將來自雄性SD大鼠的BMSC以Sx106/只的劑量經(jīng)腹腔、經(jīng)尾靜脈及肝內(nèi)注射三種途徑移植入同種雌性大鼠體內(nèi)。BMSC移植6周后分別處死各組大鼠，評價各組的生存狀態(tài)，異形細胞發(fā)生率，Sche

3、uer炎癥活動度評分法和SchmidM纖維化評分法評價肝臟病理情況，免疫組化法檢測α-SMA評價肝星狀細胞(HSC)活化情況。4、在建立四氯化碳誘導大鼠肝纖維化模型與二乙基亞硝胺(diethylnitrosamine，DEN)誘發(fā)性大鼠肝癌模型基礎上，分析TGF-β1及其信號轉(zhuǎn)導蛋白在MSC移植減輕纖維化中的作用以及減少異形細胞發(fā)生從而可能對肝硬化后肝癌發(fā)生的影響。 結(jié)果： 第一部分：利用密度梯度離心法結(jié)合MSC塑料貼壁

4、生長的特性，從成年大鼠骨髓中分離、擴增培養(yǎng)獲得形態(tài)均-的細胞集落。并在體外不同的誘導條件下，將MSC誘導分化為成骨細胞、脂肪細胞，間接證明了本實驗從骨髓中分離得到的細胞為MSC。 第二部分：第六周移植BMSC，移植4周后處死的對照組和干預組在炎癥活動度方面無明顯差異，Scheuer評分均值分別為3.73和3.58(u=-0.421，P=0.853)，但在纖維化方面，SchmidM評分均值分別為5.54和4.75(u=-2.173

5、，P=0.041)。第六周移植BMSC，移植6周后處死的對照組與干預組，Scheuer評分均值分別為3.58和0.42(u=-4.218，P<0.01)，SchmidM評分均值分別為5.17和1.58(u=-3.653，P<0101)。第六周移植BMSC，移植4周和6周后處死的兩組大鼠，Scheuer評分均值分別為3.58和0.42(u=-4.214，P<0.001)；SchmidM評分均值分別為4.75和1.58(u=-3.79，P<

6、0.011)。第八周移植BMSC，移植4周后處死的對照組和干預組在炎癥活動度與纖維化評分方面均無明顯差異，Scheuer評分均值分別為3.58和3.64(u=-0.421，P=0.860)，SchmidM評分均值分別為5.17和5.27(u=-0.352，P=0.732)。第六周與第八周移植BMSC，均在造模12周后處死的兩組大鼠間，Scheuer評分的均值分別為0.42和3.64(u=-4.146，P<0.01)；SchmidM評分均

7、值分別為1.58和5.27(u=-3.88，P<0.01)。 第三部分：第六周移植BMSC，移植6周后處死的模型組與各干預組在生存率上無明顯差異。在腹水發(fā)生率上，模型組與經(jīng)尾靜脈干預組有顯著差異。模型組和經(jīng)腹腔移植干預組在炎癥活動度、纖維化以及肝星狀細胞活化程度上均無明顯差異，Scheuer評分均值分別為3.58和2.40(u=-1.58，P=0.11)，SchmidM評分均值分別為5.17和4.70(u=-0.82，P=0.4

8、1)，α-SMA評分均值分別為2.25和1.50(u=-1.37，P=0.17)。模型組與經(jīng)尾靜脈移植干預組和肝內(nèi)移植干預組在炎癥活動度、纖維化以及肝星狀細胞活化程度上均有顯著差異，Scheuer評分均值分別為3.58、0.42和1.27(u=-4.22，P<0.01；u=-3.13，P<0.01)；SchmidM評分均值分別為5.17、1.58和3.00(u=-3.65，P<0.01；u=-2.54，P<0.01)；α-SMA評分均值

9、分別為2.25、0.58和0.55(u=-2.93，P<0.01；u=-3.11，P<0.01)。各治療組間進行兩兩對比結(jié)果顯示：經(jīng)腹腔干預組與經(jīng)尾靜脈干預組在炎癥活動度、纖維化評分上以及α-SMA的表達上均有顯著差異(P<0.05)；經(jīng)尾靜脈干預組與肝內(nèi)干預組在炎癥活動度、纖維化評分以及肝星狀細胞活化方面均無明顯差異。而經(jīng)腹腔干預組與肝內(nèi)干預組在炎癥活動度、纖維化評分上無顯著差異(P>0.05)，但在肝星狀細胞活化方面有顯著差異(u=

10、-2.43，P=0.02)。模型組異形細胞發(fā)生率為50％，經(jīng)腹腔干預組為30％，經(jīng)尾靜脈干預組為O％，肝內(nèi)干預組為9.1％。模型組與各干預組間在發(fā)生率上均有顯著差異。 第四部分：在四氯化碳誘導大鼠肝纖維化模型中，模型組與干預組在肝臟炎癥活動度、纖維化程度及HSC的活化情況上有顯著差異，Scheuer評分均值分別為3.58和0.42(u=-4.22，P<0.01)，SchmidM評分均值分別為5.17和1.58(u=-3.65，P

11、<0.01)，α-SMA評分均值分別為2.25和0.58(u=-2.93，P<0.01)。異形細胞發(fā)生率在模型組為50％，干預組為0％(P<0.05)。TGF-β1含量在兩組間也有顯著差異(F=11.024，p=0.029)，而兩組間TGF-β1信號傳導蛋白smad4和smad7無明顯差異(F=0.178，p=0.695，F(xiàn)=0.00，p=0.986)。在二乙基亞硝胺(diethylnitrosamine，DEN)誘發(fā)性大鼠肝癌模型中，

12、BMSC移植可以抑制細胞周期(G1期P=0.000，G2期P=0.000，S期P=0.000)，但不能減少肝癌發(fā)生(63.64％和33.36％，X2=2.112，P=0.22)，不能減輕肝臟炎癥活動度、纖維化程度及HSC的活化，Scheuer評分均值分別為1.82和1.75(u=-0.39，P=1.00)，SchmidM評分均值分別為5.91和5.83(u=-0.58，P=0.86)，α-SMA評分均值分別為2.00和2.67(u=-1

13、.08，P=0.29)。TGF-β1及smad4、smad7的含量在兩組間亦無差異(F=1.538，p=0.283，F(xiàn)=4.989，p=0.298，F(xiàn)=2.698，p=0.176)。 結(jié)論： 1、密度梯度離心法結(jié)合貼壁培養(yǎng)法適合于分離純化MSC，可滿足組織工程研究對大量細胞的需求。 2、肝纖維化形成早期移植BMSC可以減輕CCL4引起的肝臟炎癥程度，改善大鼠的肝纖維化程度，且與移植時間成正相關。 3、經(jīng)腹

14、腔移植BMSC對大鼠肝纖維化進程無顯著影響；經(jīng)尾靜脈與肝內(nèi)移植BMSC均可顯著減輕肝纖維化大鼠肝臟的炎癥與纖維化程度；BMSC移植可以減少肝星狀細胞的激活，減少肝纖維化進程中異形細胞發(fā)生率。 4、本研究提示，BMSC移植可能是通過抑制TGF-β1的分泌，減輕炎癥程度，減少肝星狀細胞激活進而減緩肝纖維化進程。在四氯化碳誘導大鼠肝纖維化模型中，BMSC可能通過減少TGF-β1含量調(diào)控細胞周期，進而減少異形細胞，但在二乙基亞硝胺誘發(fā)性