人參皂甙Rg3對荷瘤及環(huán)磷酰胺化療小鼠黏膜免疫的調(diào)節(jié)機制的研究.pdf

1、目的：本研究通過給小鼠原位接種C-26結(jié)腸癌及荷瘤小鼠重復(fù)灌胃環(huán)磷酰胺建立了腫瘤化療腸道黏膜損傷的模型，探討本模型黏膜免疫學(xué)特征，觀察扶正中藥人參皂甙Rg3對腫瘤化療腸道黏膜損傷的治療作用及其黏膜免疫機制。并與黏膜免疫部位進行比較，觀察黏膜免疫與系統(tǒng)免疫的相關(guān)性。 主要內(nèi)容本研究分為三個部分：一、C-26結(jié)腸癌荷瘤及環(huán)磷酰胺化療小鼠模型的建立及其黏膜免疫特點初探：(1)用C-26原位結(jié)腸癌荷瘤小鼠及環(huán)磷酰胺化療小鼠建立腸道黏膜免

2、疫功能紊亂的模型；(2)對該模型的黏膜免疫特點進行研究。①建立腸道黏膜免疫各主要部位淋巴細胞分離方法②對黏膜免疫各主要部位淋巴細胞表面標(biāo)記的研究。 二、人參皂甙Rg3對荷瘤及環(huán)磷酰胺化療小鼠黏膜免疫功能影響：(1)對黏膜免疫各部位T細胞亞群的影響；(2)對黏膜部位細胞因子IL-2、IL-10及轉(zhuǎn)錄因子Foxp3的影響。 三、人參皂甙Rg3對荷瘤及環(huán)磷酰胺化療小鼠系統(tǒng)免疫的影響：(1)對外周血T細胞亞群的影響；(2)對血清

3、中細胞因子的影響。 主要實驗方法BALB/c小鼠，隨機分組(見實驗部分)。對荷瘤模型組，Rg3組，環(huán)磷酰胺組，環(huán)磷酰胺加Rg3組小鼠接種腫瘤細胞：麻醉狀態(tài)下打開小鼠腹腔，將20μlC-26腫瘤細胞(共1×106)接種于盲腸漿膜下，縫合腹壁。造成荷瘤小鼠黏膜免疫功能受損模型。假手術(shù)組：在盲腸漿膜下注射20μl生理鹽水。環(huán)磷酰胺組從接種后第一日至第十二日，給予0.9﹪生理鹽水200μl灌胃，第十三日起至十七日，每日給予環(huán)磷酰胺200

4、μl(總劑量為5mg)灌胃。Rg3組從手術(shù)后第二日起到第十七日止，每日給予人參皂甙Rg3200μl(200mg/kg/d)灌胃。環(huán)磷酰胺加Rg3組除了與Rg3組同樣給予Rg3外，從第十三日至十七日，每日給予環(huán)磷酰胺200μl(總劑量為5mg)灌胃，于最后一次灌胃后24小時處死動物。統(tǒng)計PP結(jié)面積，用病理學(xué)方法觀察動物小腸黏膜病理形態(tài)變化，分離黏膜免疫各部位的淋巴細胞，用流式細胞儀和熒光定量PCR檢測腸黏膜中上皮內(nèi)淋巴細胞(IEL)、固有

5、層淋巴細胞(LPL)及Peyer'sPatch(PP結(jié))中T細胞亞群及IL-2、IL-10及Foxp3的mRNA表達量。摘眼球取血，取100μl全血進行免疫熒光染色，用流式細胞儀對T細胞亞群進行檢測。剩余全血2000rpm，10min離心后取血清，用ELISA測定血清中IL-2、IL-10含量。 結(jié)果：1C-26結(jié)腸癌荷瘤及環(huán)磷酰胺化療小鼠模型的建立及其黏膜免疫特點初探1.1瘤重和環(huán)磷酰胺的抑瘤率檢測結(jié)果顯示：荷瘤模型組瘤重平均

6、為1.62±0.73克，環(huán)磷酰胺組瘤重平均為1.01±0.46，兩組比較有顯著性差異(P=0.001)，環(huán)磷酰胺組抑瘤率為37.65﹪。確認(rèn)C-26原位結(jié)腸癌模型及環(huán)磷酰胺化療模型造模成功。 1.2統(tǒng)計假手術(shù)組、荷瘤模型組及環(huán)磷酰胺組小鼠腸PP結(jié)面積，進行荷瘤模型組小鼠瘤重和PP結(jié)面積的相關(guān)性分析，結(jié)果顯示：荷瘤小鼠受腫瘤影響，腸道PP結(jié)的面積明顯減少(P＜0.001)，機體黏膜局部免疫功能受損；而環(huán)磷酰胺組腸道PP結(jié)的面積進一

7、步減少(P＜0.001)，說明環(huán)磷酰胺進一步抑制了荷瘤小鼠本已受損的黏膜免疫功能。腫瘤重量與小鼠的PP結(jié)面積呈明顯的負(fù)相關(guān)(r=-0.59725)，小鼠PP結(jié)面積隨腫瘤的增大而減小。結(jié)果提示：C-26原位結(jié)腸癌小鼠和環(huán)磷酰胺治療的荷瘤小鼠均可作為黏膜免疫功能抑制模型。 1.3大體及光鏡下觀察小腸黏膜病理變化：假手術(shù)組小腸腸壁較厚，PP結(jié)數(shù)量較多，突出腸壁，厚度明顯大于周圍腸壁。荷瘤模型組腸壁粘連，腫瘤侵犯腸壁，腸壁厚度比假手術(shù)組

8、略薄，PP結(jié)數(shù)量比假手術(shù)組減少，PP結(jié)直徑變小。環(huán)磷酰胺組腸壁薄而易斷，PP結(jié)數(shù)量明顯減少，PP結(jié)直徑變小，甚至部分動物無肉眼可見的PP結(jié)。光鏡下假手術(shù)組小腸黏膜絨毛完整，上皮細胞排列整齊緊密。荷瘤模型組黏膜及黏膜下肌層明顯變薄，上皮細胞排列不緊密，黏膜固有層細胞數(shù)量較少?；熃M小腸絨毛圓鈍，上皮細胞排列疏松，間距增加，部分上皮細胞可見空泡變性。上皮細胞核固縮，深染，部分胞核崩解，淡染。黏膜固有層細胞數(shù)明顯減少。黏膜上皮及淺表的腺體剝脫

9、，黏膜上皮局灶性壞死，腺體數(shù)目減少，肌層變薄。 1.4小腸黏膜免疫各部位淋巴細胞的分離方法的建立：通過胎盼藍染色及石蠟切片和HE染色對淋巴細胞活性進行了檢測，用流式細胞分析儀對所分離的腸黏膜淋巴細胞進行了鑒定。經(jīng)分離純化步驟，每只鼠可獲得2～6×106個IEL，2～5×106個LPL及5～10×106個PP結(jié)淋巴細胞，活力＞90﹪。病理切片顯示：經(jīng)消化液振蕩消化后，小鼠小腸絨毛黏膜上皮基本與固有層分離，有些部位甚至完全脫落。同時

10、黏膜固有層及淋巴小結(jié)保持完整。膠原酶消化后可見固有層解離而黏膜肌層保持完整。以上結(jié)果顯示：本實驗成功地分離了腸道黏膜各部位淋巴細胞，且分離方法穩(wěn)定，高效。 1.5流式細胞分析儀檢測各組小鼠小腸黏膜各部位淋巴細胞CD3+、CD4+、CD8+表面標(biāo)志的測定結(jié)果顯示： IEL中CD4+的淋巴細胞百分比，假手術(shù)組明顯高于荷瘤模型組和環(huán)磷酰胺組(P＜0.001)，環(huán)磷酰胺組CD4+的淋巴細胞與荷瘤模型組相比有降低的趨勢(P=0.1

11、41)。LPL中CD4+的淋巴細胞百分比，假手術(shù)組高于荷瘤模型組(P=0.044)，更明顯高于環(huán)磷酰胺組(P＜0.001)，環(huán)磷酰胺組CD4+的淋巴細胞明顯低于荷瘤模型組(P＜0.001)。 IEL中CD8+的淋巴細胞百分比，環(huán)磷酰胺組與假手術(shù)組及荷瘤模型組比較顯著增高(P值均為0.024)。LPL中CD8+的淋巴細胞百分比，荷瘤模型組明顯高于假手術(shù)組(P=0.042)，環(huán)磷酰胺組與假手術(shù)比較也有增高趨勢(P=0.077)。PP

12、結(jié)中CD8+的淋巴細胞百分比，假手術(shù)組明顯低于環(huán)磷酰胺組(P=0.001)。 2人參皂甙Rg3對荷瘤及環(huán)磷酰胺化療小鼠黏膜免疫功能的影響2.1運用上述荷瘤及環(huán)磷酰胺化療小鼠作為腸道黏膜免疫紊亂的模型，研究人參皂甙Rg3對其黏膜免疫的影響。發(fā)現(xiàn)Rg3對未經(jīng)化療及化療后的瘤重都無明顯影響(P值分別為0.778和0.999)，即人參皂甙Rg3對腫瘤瘤體無促進作用，但可明顯抑制環(huán)磷酰胺所致的PP結(jié)面積減少(P=0.03)。 2.

13、2在對腸道黏膜免疫各部位淋巴細胞亞群的影響上，Rg3組的PP結(jié)CD8+細胞百分比與荷瘤模型組相比也有增高的趨勢(P=0.085)。對IEL的檢測結(jié)果顯示：荷瘤模型組及環(huán)磷酰胺組與假手術(shù)組相比CD4+細胞百分比明顯降低(P＜0.001)，而Rg3組CD4+細胞百分比明顯高于荷瘤模型組及環(huán)磷酰胺組(P＜0.01)，且環(huán)磷酰胺加Rg3組CD4+細胞百分比明顯高于環(huán)磷酰胺組。說明Rg3能明顯改善IEL中因荷瘤及環(huán)磷酰胺化療導(dǎo)致的CD4+細胞百分

14、比下降，恢復(fù)IEL中正常的CD4+細胞百分比，這可能是Rg3調(diào)節(jié)黏膜免疫的作用機制之一。而荷瘤，環(huán)磷酰胺及人參皂甙Rg3對于IEL中γδTCR+細胞均無明顯影響。對LPL的檢測結(jié)果顯示：Rg3組小鼠LPL中CD4+細胞百分比較荷瘤模型組顯著增高(P=0.024)，而環(huán)磷酰胺加Rg3組也較環(huán)磷酰胺組顯著增高(P=0.006)。說明Rg3可明顯恢復(fù)因荷瘤和環(huán)磷酰胺化療所致的LPLCD4+細胞百分比低下。Rg3組小鼠LPL中CD8+細胞百分比

15、與荷瘤模型組相比有降低的趨勢(P=0.075)。 2.3RT-PCR檢測黏膜各部位淋巴細胞中Foxp3、IL-2、IL-10mRNA的表達結(jié)果顯示： 除了Rg3因增加了LPL中表達Foxp3的Treg細胞數(shù)量而對LPL中CD4+的百分比變化有一定程度地貢獻外，其余各組T細胞亞群的變化均來自Treg細胞以外的各種細胞亞群。 荷瘤小鼠黏膜各部位的淋巴細胞中IL-2mRNA的水平有不同程度的降低，而IL-10mRNA水

16、平有不同程度的升高，即荷瘤動物在黏膜免疫部位也存在Th1/Th2免疫反應(yīng)平衡向Th2方向漂移的現(xiàn)象。環(huán)磷酰胺、Rg3及環(huán)磷酰胺加Rg3可使黏膜各部位的淋巴細胞IL-2mRNA水平不同程度的升高，而對IL-10mRNA水平?jīng)]有明顯的影響。 3人參皂甙Rg3對荷瘤及環(huán)磷酰胺化療小鼠系統(tǒng)免疫的影響3.1荷瘤及環(huán)磷酰胺明顯增高血中CD4+的淋巴細胞百分比，降低血中CD8+的淋巴細胞百分比。人參皂甙Rg3對外周血T細胞亞群無顯著影響。

17、 3.2血清ELISA結(jié)果顯示：荷瘤可能在一定程度上上調(diào)小鼠血清中IL-10含量(P=0.067)，而環(huán)磷酰胺能降低血清中IL-10含量(P=0.032)，Rg3也能降低血清IL-10(P＜0.001)。各組小鼠血清中IL-2含量未見顯著性差異(P＞0.05)。 結(jié)論：C-26原位結(jié)腸癌模型及荷瘤小鼠環(huán)磷酰胺化療模型腸道黏膜均有明顯的大體和微觀形態(tài)學(xué)改變，并且其腸道黏膜免疫各部位的淋巴細胞和相關(guān)細胞因子也多有不同程度的變化，