豬附植前期不同形狀孕體差異表達基因的篩選與PLET1基因在胎盤發(fā)育中的功能初步研究.pdf

1、妊娠期豬胚胎/胎兒死亡會導致產(chǎn)仔數(shù)降低，而胎兒宮內(nèi)發(fā)育遲緩會造成低初生重仔豬數(shù)目增加，這些低出生重的仔豬對疾病的抵抗能力及飼料利用率均降低，因此，嚴重影響母豬的繁殖效率。胚胎的附植及胎盤的建立和發(fā)育直接影響著胎盤效率，是成功妊娠的重要過程。胎盤的大小及轉(zhuǎn)運功效決定了胎盤效率的高低，在附植前期及附植期，豬孕體滋養(yǎng)層會經(jīng)歷一個形態(tài)迅速重塑的過程，其形態(tài)從球形(約10mm)逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)榫€狀（約150mm），滋養(yǎng)層擴張重塑的目的是在子宮中占據(jù)足夠

2、的位置進行附植，因而也決定了胎盤的大小。隨后孕體滋養(yǎng)層上皮細胞與子宮內(nèi)膜上皮細胞粘附形成上皮絨毛膜型胎盤，建立母體與胎兒之間的轉(zhuǎn)運通道。因此本研究首先以滋養(yǎng)層快速重塑的球形和線形孕體為材料，通過差異表達基因的篩選，檢測與豬胚胎附植及胎盤建立相關的基因及調(diào)控通路。其次，從差異表達基因中選取PLET1基因為候選基因，研究該基因在胎盤建立及發(fā)育中的調(diào)控機制，研究結果如下:
　　1.通過芯片雜交分析分別篩選到梅山和大白豬的球形和線狀孕體中

3、的差異表達基因，對比發(fā)現(xiàn)只在大白豬中上調(diào)表達的基因有410個，下調(diào)表達的基因有634個。只在梅山豬中上調(diào)表達基因288個，下調(diào)表達基因292個。因此，大白豬孕體中的差異表達基因遠多于梅山豬，即梅山豬孕體在附植前期的基因表達更趨于平穩(wěn)。此外，兩個品種中共同上調(diào)表達基因有345個和共同下調(diào)表達基因有379個，推測這些基因可能是調(diào)控孕體發(fā)育所必需的基因。對差異表達基因進行功能分類和信號通路分析，發(fā)現(xiàn)兩個品種豬孕體中差異表達基因均涉及與血管生成

4、、激素應答、細胞增殖等，說明這些過程是孕體延長所必需的，同時也發(fā)現(xiàn)只在梅山豬孕體中差異表達基因涉及的信號通路主要是與細胞外基質(zhì)作用、胺類生物合成、黏著斑等少數(shù)信號途徑，而只在大白豬孕體中差異表達基因則涉及激素合成、補體系統(tǒng)、粘多糖降解、鈣離子信號途徑等多個信號通路，也說明大白豬孕體在延長過程中基因表達變化可能會引起細胞的許多功能發(fā)生改變。
　　2.PLET1是一個在形態(tài)重塑期的梅山豬和大白豬孕體中均上調(diào)表達的基因，推測其表達可能對

5、孕體滋養(yǎng)層的延長是必要的。我們首先檢測PLET1基因的表達模式，發(fā)現(xiàn)PLET1在囊胚期表達量較低，而在附植后直到整個妊娠末期表達量迅速上升，驗證了PLET1基因是一個胚胎延長期的差異表達基因，并且發(fā)現(xiàn)PLET1基因在豬胎盤發(fā)育過程中也是上調(diào)表達，說明其可能也參與胎盤的發(fā)育過程。
　　3.對豬PLET1基因的進一步研究發(fā)現(xiàn):(1)通過原位雜交及免疫熒光檢測到PLET1只在孕體和胎盤滋養(yǎng)層細胞表達，證明其可以作為胎盤中滋養(yǎng)層細胞的標記

6、基因，用于滋養(yǎng)層細胞的分選。(2) PLET1在妊娠不同時期的滋養(yǎng)層細胞中的表達定位也發(fā)生變化，即從妊娠50天開始，隨著胎盤褶皺的形成和進一步發(fā)育，PLET1蛋白逐漸向滋養(yǎng)層細胞頂端聚集，表達位置進一步貼近母體子宮內(nèi)膜上皮細胞，推測PLET1可能影響滋養(yǎng)層細胞與母體子宮內(nèi)膜細胞的相互作用。(3)通過3'RACE技術鑒定到豬胎盤中表達3'UTR長度不同的兩個轉(zhuǎn)錄本，證實這兩個轉(zhuǎn)錄本是由于選擇性加尾信號導致的，并且熒光定量分析結果顯示，兩個

7、轉(zhuǎn)錄本的表達量比值隨著妊娠的進程而改變，說明雖然這兩個轉(zhuǎn)錄本編碼相同的蛋白質(zhì)，但是它們在胎盤的發(fā)育過程中發(fā)揮的功能可能并不完全相同。(4)在體外細胞中的研究發(fā)現(xiàn)PLET1基因的長轉(zhuǎn)錄本表達活性更高，并且PLET1的表達受miR-181a、miR-181c和miRNA-365-3p的調(diào)控。
　　4.對PLET1蛋白進行氨基酸序列分析，預測其可能存在N-連接的糖基化修飾，經(jīng)蛋白質(zhì)糖基化檢測發(fā)現(xiàn)PLET1蛋白在胎盤中主要是以糖基化形式存