中藥現(xiàn)場(chǎng)、快速鑒別方法的建立——以金銀花為例.pdf

1、快速、簡(jiǎn)便、現(xiàn)場(chǎng)化的分子鑒別方法一直是中藥分子鑒別的追求。金銀花為臨床常用大宗中藥材，在中藥方劑及中成藥中具有廣泛應(yīng)用。2010版《中國(guó)藥典》規(guī)定金銀花的唯一植物基原為忍冬科植物忍冬(Lonicera japonica Thunb.)。然而，之前各版《中國(guó)藥典》根據(jù)臨床療效、地區(qū)用藥習(xí)慣等，曾先后選定忍冬、紅腺忍冬、華南忍冬、水忍冬等作為金銀花正品來(lái)源，由于形態(tài)學(xué)高度相似，民間混用情況非常普遍。同時(shí)因金銀花與同屬偽品尤其是山銀花品種形態(tài)

2、學(xué)及化學(xué)成分高度相似，使用傳統(tǒng)方法難以到達(dá)鑒別目的。因此急需建立快速準(zhǔn)確的金銀花分子鑒別方法。
　　 雖然之前的研究者使用了ISSR、PCR-RFLP、DNA條形碼等技術(shù)從分子水平上鑒別金銀花及其偽品，但這些方法均達(dá)不到快速、鑒別鑒別的目的。也難以對(duì)金銀花混偽品及含金銀花中成藥進(jìn)行鑒別。
　　 本研究建立了4種金銀花鑒別方法，探索了金銀花快速鑒別技術(shù)、現(xiàn)場(chǎng)技術(shù)及金銀花混雜品與含金銀花中成藥的鑒別，建立了快速、簡(jiǎn)便的金銀花

3、分子鑒別方法。本論文主要包括以下5個(gè)方面的內(nèi)容:
　　 一、金銀花分子鑒別方法的建立和及應(yīng)用。
　　 1、金銀花EST-SSR分子鑒別方法的建立。
　　 本研究通過(guò)生物信息學(xué)手段對(duì)本實(shí)驗(yàn)室保存的忍冬及其變種紅白忍冬EST序列進(jìn)行分析，共獲得3705條忍冬EST-SSRs及2818條紅白忍冬EST-SSRs。通過(guò)同源比對(duì)，在忍冬及其變種中共篩選出87對(duì)重復(fù)次數(shù)具有差異的EST-SSR。選出15對(duì)堿基數(shù)差異大于6的E

4、ST-SSR進(jìn)行驗(yàn)證，選出了jp.ssr4、jp.ssr64及jp.ssr65等3對(duì)引物用于忍冬及其變種、山銀花原植物的鑒別。
　　 2、金銀花PCR-RFLP分子鑒別方法的建立。
　　 通過(guò)序列比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)金銀花PsbA-TrnH序列190存在一個(gè)G/T變異位點(diǎn)，致使金銀花能被內(nèi)切酶HinfⅠ(G(^)ANTC)酶切而其偽品不能;金銀花TrnL-TrnF序列625存在一個(gè)C/A變異位點(diǎn)，致使金銀花能被內(nèi)切酶NlaⅣ(

5、GGNN(^)CC)酶切而其偽品不能。分別使用PsbA-TrnH通用引物及TrnL-TrnF對(duì)96份金銀花樣品及69份偽品樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，使用HinfⅠ及NlaⅣ進(jìn)行限制性內(nèi)切酶消化成功鑒別了金銀花及其偽品。
　　 3、金銀花位點(diǎn)特異性PCR鑒別方法的建立。
　　 通過(guò)金銀花TrnL-TrnF序列625 C/A變異位點(diǎn)設(shè)計(jì)位點(diǎn)特異性PCR引物，對(duì)84份金銀花基原植物及其市售飲片、偽品進(jìn)行雙向位點(diǎn)特異性PCR擴(kuò)增，退火

6、溫度為61℃時(shí)，正品均出現(xiàn)468 bp的條帶，紅腺忍冬、華南忍冬、灰氈毛忍冬、黃褐毛忍冬、水忍冬、金銀忍冬、郁香忍冬、新疆忍冬、繁果忍冬等9個(gè)偽品均出現(xiàn)324 bp的條帶，單次PCR即可鑒別正品和偽品。
　　 4、金銀花環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增鑒別方法的建立。
　　 根據(jù)TrnL-TrnF序列625 C/A變異位點(diǎn)設(shè)計(jì)了環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)引物組，對(duì)21份金銀花類中藥及50份其他種屬物種進(jìn)行LAMP鑒別。當(dāng)設(shè)定孵育溫度為63

7、℃時(shí)，擴(kuò)增完成加入SYBR GreenⅠ熒光染料時(shí)，金銀花類中藥均顯強(qiáng)烈熒光而其偽品顯出極弱熒光。當(dāng)溫度為65℃時(shí)，能鑒別金銀花與其同時(shí)偽品。
　　 通過(guò)對(duì)比選出了位點(diǎn)特異性PCR及環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增用于金銀花的鑒別。
　　 使用金銀花位點(diǎn)特異性PCR技術(shù)構(gòu)建雙向位點(diǎn)特異性PCR組(LJ1 F、LJ1 R、L J2 F、LJ2 R)對(duì)金銀花摻偽品進(jìn)行了鑒別。在正品中摻入5％以上偽品即可準(zhǔn)確鑒別，此時(shí)金銀花出現(xiàn)765 bp及4

8、68 bp的條帶，偽品出現(xiàn)765 bp及324 bp條帶，摻偽品出現(xiàn)3條條帶。
　　 使用金銀花位點(diǎn)特異性PCR技術(shù)對(duì)復(fù)方魚腥草片、羚羊感冒片、銀翹解毒片等3個(gè)含金銀花生藥原粉的中成藥進(jìn)行了鑒別，使用PCR-RFLP進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)所檢測(cè)的3個(gè)市售中成藥中均含有金銀花與山銀花。對(duì)3個(gè)中成藥進(jìn)行克隆測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)復(fù)方魚腥草片可能含金銀花及華南忍冬，羚羊感冒片可能含金銀花及紅腺忍冬，銀翹解毒片可能含金銀花、華南忍冬、灰氈毛忍冬及紅腺忍冬

9、。
　　 使用金銀花LAMP技術(shù)設(shè)計(jì)引物組DCC-F3、DCC-B3、DCC-FIP、DCC-BIP對(duì)金銀花毒性偽品斷腸草原植物及其水提液進(jìn)行了鑒別，當(dāng)加入羥基萘酚藍(lán)染料后63℃恒溫?cái)U(kuò)增1h后，斷腸草顯天藍(lán)色而金銀花類藥材顯藍(lán)紫色。
　　 二、中藥材DNA的快速提取。
　　 通過(guò)優(yōu)選0.5 M氫氧化鈉、1％ PVP和1％Triton X-100作為提取緩沖液，使用堿裂解法提取144個(gè)中藥材DNA，動(dòng)物藥使用COⅠ

10、、植物藥使用PsbA-TrnH通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中123個(gè)中藥獲得了陽(yáng)性擴(kuò)增結(jié)果，擴(kuò)增成功率為85.2％。
　　 使用堿裂解法提取DNA用于烏梢蛇、金錢白花蛇及金銀花鑒別。使用堿裂解法10 min提取DNA，用烏梢蛇鑒別引物、金錢白花鑒別蛇引物及本文建立的金銀花鑒別引物進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果與原有DNA提取方法獲得的結(jié)果一致。
　　 三、PCR增強(qiáng)劑在金銀花鑒定中的使用分析。
　　 分別利用CTAB法和堿裂解法提

11、取的180個(gè)中藥材DNA樣品，在PCR反應(yīng)體系中使用0.5％BSA與與1％ PVP組合作為PCR增強(qiáng)劑，研究增強(qiáng)劑對(duì)通用引物ITS2、PsbA-TrnH、rbcL、matK、TrnL-TrnF片段PCR成功率的影響，發(fā)現(xiàn)0.5％BSA與與1％ PVP組合能顯著增加通用引物PCR成功率。能提高位點(diǎn)特異性PCR鑒別穩(wěn)定性，減少假陰性結(jié)果產(chǎn)生。
　　 四、金銀花快速鑒別體系的建立。
　　 使用堿裂解法提取金銀花真?zhèn)纹分兴幉?，設(shè)

12、計(jì)引物L(fēng) J-RAPID-1F及LJ-RAPID-1R進(jìn)行位點(diǎn)特異性PCR鑒別，調(diào)整PCR反應(yīng)程序?yàn)?7℃預(yù)變性1 min;87℃變性0s，68℃5s進(jìn)行30個(gè)循環(huán);加入熒光染料SYBR GreenⅠ紫外比色。能在26 min內(nèi)完成PCR反應(yīng)，整個(gè)鑒別過(guò)程費(fèi)時(shí)不超過(guò)40 min。
　　 五、金銀花現(xiàn)場(chǎng)鑒別體系的建立。
　　 通過(guò)使用堿裂解法提取DNA，配制便攜的恒溫加熱槽、手持式電動(dòng)研磨儀及紫外燈，初步構(gòu)建了金銀花現(xiàn)場(chǎng)鑒

13、別體系并成功用于金銀花毒性偽品斷腸草的現(xiàn)場(chǎng)鑒定。完成檢測(cè)所需時(shí)間為1.5 h。
　　 結(jié)論:
　　 通過(guò)建立金銀花位點(diǎn)特異性PCR及環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，使用堿裂解法提取DNA，PCR增強(qiáng)劑增加位點(diǎn)特異性PCR穩(wěn)定性，建立快速位點(diǎn)特異性PCR，本研究構(gòu)建了金銀花快速鑒別體系及金銀花現(xiàn)場(chǎng)鑒別體系。能在40 min內(nèi)完成金銀花的鑒別，在1.5 h內(nèi)不需要大型儀器現(xiàn)場(chǎng)鑒別金銀花毒性偽品。
　　 本研究首次嘗試了對(duì)金銀花摻

14、偽品的鑒別及3種含金銀花原粉的中成藥的鑒別，可檢測(cè)正品中5％以上的偽品摻入量。通過(guò)位點(diǎn)特異性PCR快速檢測(cè)含金銀花原粉的中成藥中金銀花的真?zhèn)吻闆r，其結(jié)果與PCR-RFLP以及克隆測(cè)序結(jié)果相符。
　　 本研究建立了中藥材DNA的堿裂解提取法，能在10 min時(shí)間內(nèi)獲得DNA模板用于擴(kuò)增，研究了PCR增強(qiáng)劑對(duì)CTAB提取DNA及堿裂解法提取DNA的增強(qiáng)作用。有助于解決中藥材分子鑒別擴(kuò)率低的問(wèn)題。
　　 通過(guò)金銀花位點(diǎn)特異性P