STAT3在小鼠胚胎神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中的表達及與NTD的相關性研究.pdf

1、神經(jīng)系統(tǒng)是機體最重要和最復雜的系統(tǒng),它謎一樣的發(fā)生過程一直吸引著發(fā)育神經(jīng)生物學家的關注.而其中神經(jīng)管的發(fā)生是關系到建立中樞神經(jīng)系統(tǒng)(Central nervous system, CNS)原基的重要胚胎學事件,在這個過程中,神經(jīng)板必須準時準確地關閉形成神經(jīng)管,神經(jīng)系統(tǒng)才能得以正常發(fā)育,否則將出現(xiàn)神經(jīng)管缺陷(neural tube defect,NTD)和隨之而來的脊柱裂或無腦等常見畸形.NTD的發(fā)病率在世界范圍內占出生嬰兒的0.1~0.

2、9﹪,給家庭和社會帶來了嚴重負擔.但是迄今對此復雜過程的基因表達與確切調控途徑均知之甚少,所以正常神經(jīng)管形成的分子機制和NTD的發(fā)病機理已成為當今神經(jīng)科學研究的熱點和前沿.研究發(fā)現(xiàn),胚胎9.5天(E9.5d)時,作為轉錄因子的信號轉導和轉錄激活因子-3(signal transducer and activator of transcription factor-3,STAT3)在早期胚胎發(fā)育中的腦區(qū)有較高水平的表達,而E9.5d正是神

3、經(jīng)管關閉的重要時期,這是否提示STAT3有可能參與神經(jīng)管的關閉呢?它的表達異常是否和NTD的發(fā)生相關呢?神經(jīng)管閉合后,神經(jīng)管上皮細胞的進一步增生、分化和遷移,它的前端呈現(xiàn)三個膨大,依次稱為前腦泡、中腦泡和菱腦泡,前腦泡發(fā)育為端腦和間腦,中腦泡發(fā)育為中腦,菱腦泡的前部發(fā)育為后腦,以后演變?yōu)槟X橋和小腦,菱腦泡的后部發(fā)育延髓,神經(jīng)管尾端形成未來的脊髓.神經(jīng)管上皮細胞的增生、分化和遷移對于神經(jīng)系統(tǒng)正常結構和功能的建立十分重要.近年研究發(fā)現(xiàn),有許

4、多基因參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的調控,外環(huán)境也是通過這些基因發(fā)揮作用的.作為轉錄因子的STAT3參與很多基因的表達和調控,并與其他轉錄因子形成復雜的調控網(wǎng)絡.在胚胎神經(jīng)系統(tǒng)尤其是神經(jīng)上皮內檢測到STAT3的表達,它是否可能通過啟動不同靶基因表達來參與神經(jīng)管上皮細胞的增生、分化和遷移呢?研究提示,成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factor, FGF)參與調節(jié)早期神經(jīng)發(fā)育階段的許多關鍵過程,對雞胚的研究發(fā)現(xiàn)FGF可能作

5、為直接的神經(jīng)誘導分子,其中FGF-8只在胚胎的早期增殖和神經(jīng)發(fā)生階段表達,涉及神經(jīng)的早期發(fā)育和分化.已知FGFs是激活STAT的重要生長因子之一,并且FGF2與受體結合后可以激活STAT3,由于FGF家族成員之間序列有高度的同源性,提示FGF8也可能激活STAT3而啟動基因轉錄.FGF8是否可能作為STAT3上游的分子和STAT3共同促使神經(jīng)管關閉呢?迄今對神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育尤其是神經(jīng)管關閉和NTD復雜過程的基因表達與調控的研究剛剛起步,涉及

6、此過程的基因與具體調控途徑均知之甚少,目前對正常神經(jīng)管形成和NTD發(fā)生過程中的信號轉導通路及分子機制的研究也尚無明確定論.該實驗采用全胚胎原位雜交技術、免疫組織化學技術、免疫細胞熒光染色技術等方法,觀察到了STAT3在胚胎發(fā)育中時空表達規(guī)律,尤其在神經(jīng)胚形成階段和神經(jīng)上皮增生、分化和遷移中的表達變化規(guī)律;并利用喂服過量維甲酸(retinoic acid, RA)誘導NTD模型,觀察發(fā)生NTD的胚胎STAT3的表達變化;同時采用全胚胎原位

7、雜交技術觀察FGF8在正常胚胎神經(jīng)胚形成(neurulation)過程中的表達和在NTD中的表達變化,并比較了FGF8和STAT3變化規(guī)律及其關系,旨在探討STAT3在正常神經(jīng)上皮發(fā)育及神經(jīng)管關閉過程中的作用,試圖揭示STAT3信號轉導通路在胚胎神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中的作用和可能的分子機制.結果如下:一、STAT3在小鼠胚胎神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中的表達1、采用全胚胎原位雜交技術可觀察到E8.75~11.5d小鼠胚胎STAT3的表達情況,在E8.75

8、d時整個鼠胚幾乎沒有觀察到STAT3 mRNA的表達,在E9.5d,隨著神經(jīng)管的逐漸關閉,STAT3 mRNA在前腦泡急劇增多,到E10.5d,陽性信號由前腦泡轉移至中腦泡,E11.5d時僅在后腦泡的一狹窄區(qū)域檢測到STAT3 mRNA的表達.STAT3胚胎神經(jīng)組織的表達,尤其是神經(jīng)管頭段STAT3的表達及其時空變化,提示STAT3有可能參與了這個時期神經(jīng)管的關閉以及神經(jīng)管頭段的發(fā)育.2、該實驗用酶免疫組織化學方法觀察到在E13.5d,

9、在側腦室周圍即未來大腦新皮層區(qū)域、間腦、發(fā)育中的視網(wǎng)膜、第四腦室周圍的腦組織(未來的腦橋)、脊髓、三叉神經(jīng)節(jié)和背根神經(jīng)節(jié)C1均可觀察到較強的STAT3陽性信號.E13d正是神經(jīng)上皮套層細胞開始向邊緣層遷移的時候,此時各腦區(qū)大量細胞表達STAT3,提示STAT3可能參與了神經(jīng)前體細胞的分化和遷移.用熒光免疫組織化學方法觀察,E14.5d和E15.5d時,大腦皮層、間腦、視網(wǎng)膜、第四腦室周圍以及發(fā)育中的腦橋和脊髓等部位均可觀察到發(fā)中等強度熒

10、光的細胞,提示在細胞基本完成遷移和分化后,STAT3的表達有所下降.二、STAT3與RA致小鼠NTD的關系1、與正常對照組相比,喂服RA后孕鼠在E9.5~10.5d可觀察到前腦頂部和后腦未閉合的畸形胚胎,在少數(shù)胚胎可觀察到整個神經(jīng)管未閉合,呈開放狀態(tài).表明該劑量的RA可以造成CNS發(fā)育的缺陷.2、采用全胚胎原位雜交技術可以觀察到RA誘導所致NTD畸形的鼠胚STAT3表達變化的情況,在E9.5、10.5d時 STAT3 mRNA的表達較正

11、常胚胎減少,在前腦泡和中腦泡未觀察到明顯的STAT3 mRNA表達;E11.5d的胚胎神經(jīng)管已關閉,與正常鼠胚相比STAT3 mRNA的表達無明顯變化.研究發(fā)現(xiàn),STAT3分子可以啟動一些促進細胞存活的基因轉錄,如Bcl-2和Bcl-XL,從而維持細胞的存活.NTD發(fā)生時伴有的STAT3表達下調,這可能是由于RA通過其受體介導引起STAT3 mRNA的表達下調,影響了Bcl-2和Bcl-XL這類維持細胞存活的基因轉錄并合成相應蛋白質,從

12、而使神經(jīng)管關閉過程中的細胞存活受到抑制,促進細胞的凋亡,導致了NTD發(fā)生.三、FGF8在正常神經(jīng)管形成和NTD中的表達變化及其與STAT3的關系研究1、采用全胚胎原位雜交技術可觀察到E8.75~11.5d小鼠胚胎FGF8的表達情況,在E8.75d整個鼠胚幾乎沒有觀察到FGF8 mRNA的表達,在E9.5、10.5d,在前腦泡的前緣、腦峽部位(中腦和后腦之間的一個狹窄區(qū)域)和神經(jīng)管的尾端可以觀察到較局限的FGF8 mRNA表達,但是E10

13、.5d時,上述三個部位的表達較E9.5d減弱;E11.5d腦峽部位基本已無FGF8 mRNA的表達,FGF8 mRNA主要集中在中腦部位.在NTD畸形鼠胚中,E9.5d時可以觀察到腦峽部位的染色較正常減弱;E10.5d時NTD鼠胚腦峽部位較正常染色加深,且范圍擴大.E9.5d時FGF8在正常胚胎神經(jīng)管的表達及NTD時其表達減弱說明FGF8可能參與了神經(jīng)管關閉,其表達減弱可能是導致NTD發(fā)生的機制之一;E10.5d時NTD鼠胚腦峽部位FG

14、F8的表達增強,可能是通過增強FGF8表達試圖促進神經(jīng)管關閉,就出現(xiàn)了FGF8 mRNA表達的增強.2、STAT3和FGF8的表達在正常胚胎有重疊,尤其是前腦泡.在NTD模型中二者都發(fā)生了變化,E9.5d時FGF8和STAT3二者的表達都減弱,E10.5d時腦峽部位FGF8表達增強,且范圍擴大,而STAT3表達依然減弱.結果提示,神經(jīng)管關閉時FGF8可能激活STAT3,二者共同作用使神經(jīng)管關閉;當二者表達下調時,由于阻斷了的正常信號轉導