動(dòng)態(tài)激光散射測(cè)量純化蛋白粒徑及對(duì)粒徑與分子量關(guān)系的研究.pdf

1、本課題主要建立了一套動(dòng)態(tài)激光散射裝置，對(duì)測(cè)量光路進(jìn)行了調(diào)試校準(zhǔn)；對(duì)動(dòng)態(tài)激光散射原理進(jìn)行了分析，對(duì)數(shù)據(jù)分析方法進(jìn)行了比較；就動(dòng)態(tài)激光散射技術(shù)在生物大分子顆粒粒徑及其分布、分子量與粒徑之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系等多個(gè)方面的研究應(yīng)用進(jìn)行實(shí)驗(yàn)和討論，通過對(duì)純化蛋白樣品的測(cè)試，并且結(jié)合相應(yīng)的數(shù)據(jù)分析方法從而得出適合于測(cè)試純化的蛋白樣品的數(shù)據(jù)分析方法，與傳統(tǒng)的納米顆粒測(cè)試相比，該研究是專門針對(duì)于生物大分子的，我們預(yù)期通過這種針對(duì)性的研究，將進(jìn)一步提高生物大分子

2、體系中樣品粒度及其分布的測(cè)量結(jié)果的可靠性和精度. 實(shí)驗(yàn)儀器和數(shù)據(jù)處理：實(shí)驗(yàn)采用自主建立并裝配的一動(dòng)態(tài)激光散射裝置，動(dòng)態(tài)光散射(DLS)是利用處于布朗運(yùn)動(dòng)中的生物大分子、分子集團(tuán)或顆粒的散射光的強(qiáng)度隨時(shí)間而波動(dòng)的情況，來分析其在溶液中的粒子大小、尺寸分布等聚合方面性質(zhì)的.散射光強(qiáng)度的波動(dòng)用自相關(guān)函數(shù)來分析，分析軟件提供單指數(shù)分析方法(Exponentialsampling)、累計(jì)分析方法(CumulantAnalysis)、雙指數(shù)

3、分析方法(DoubleExponential)、非負(fù)約束的最小二乘分析方法(Non-NegativelyConstrainedLeastSquares：Multiplepass)、修正的非負(fù)約束的最小二乘分析方法(Non-NegativelyConstrainedLeastSquares：Regularized)五種分析方法.對(duì)于單分散體系，光強(qiáng)的時(shí)間相關(guān)函數(shù)為：G(2)(τ)=A(1+β|g(1)(τ)|2)A為基線，理論上為1.0，

4、β儀器常數(shù)，τ衰減時(shí)間，散射向量q=4πnsin(θ/2)，n為折射率，θ為散射角.從自相關(guān)函數(shù)的衰減率可以直接得到平移擴(kuò)散系數(shù)D，流體動(dòng)力學(xué)半徑RH可由D通過Stokes-Einstein方程導(dǎo)出RH=kBT/6πηD，其中kB為波爾茲曼常數(shù)，T為絕對(duì)溫度，η溶液的粘度. 實(shí)驗(yàn)樣品與試劑：聚苯乙烯微球水懸浮液購(gòu)自中國(guó)石油大學(xué)重質(zhì)油國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，用于校正光路.純化的馬血清球蛋白和純化的卵黃抗體由公共衛(wèi)生學(xué)院流行病與衛(wèi)生統(tǒng)計(jì)學(xué)教

5、研室提供. 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容： ①建立一套動(dòng)態(tài)激光散射裝置. ②調(diào)整設(shè)置光路，通過對(duì)光路中光源偏振狀態(tài)的監(jiān)測(cè)、pinhole的設(shè)置.使得光路參數(shù)調(diào)整到最佳狀態(tài).然后對(duì)標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行測(cè)量，標(biāo)準(zhǔn)樣品為單分散體系聚苯乙烯球乳狀液，標(biāo)準(zhǔn)值為347±12nm. ③對(duì)動(dòng)態(tài)激光散射原理進(jìn)行分析. ④對(duì)數(shù)據(jù)分析方法進(jìn)行比較. ⑤利用克隆技術(shù)得到純化蛋白，用動(dòng)態(tài)激光散射測(cè)量其粒徑及其分布，找到粒徑與分子量的對(duì)應(yīng)關(guān)系.

6、 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： ①通過對(duì)聚苯乙烯微球水懸浮液的測(cè)量，該動(dòng)態(tài)激光散射裝置可以對(duì)納米顆粒的粒徑及其分布進(jìn)行準(zhǔn)確的測(cè)量. ②測(cè)量結(jié)果：實(shí)驗(yàn)結(jié)論：和傳統(tǒng)的生物大分子分離檢測(cè)技術(shù)相比較，動(dòng)態(tài)激光散射技術(shù)有獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)：①動(dòng)態(tài)激光散射技術(shù)能夠在對(duì)生物樣品未進(jìn)行物理化學(xué)分離的情況下，研究其組分，各組分的平動(dòng)擴(kuò)散系數(shù)、粒徑等參數(shù).②動(dòng)態(tài)激光散射技術(shù)檢測(cè)生物大分子快速、無(wú)擾、高靈敏度、高分辨率. 通過本課題研究，得到如下結(jié)論：

7、 1.我們建立的動(dòng)態(tài)激光散射裝置能夠測(cè)量粒徑大小，且通過對(duì)動(dòng)態(tài)激光散射原理的分析，數(shù)據(jù)分析理論的比較和實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)樣品的測(cè)量，可得出NNLS和CONTIN算法所擬合的結(jié)果比較可靠和準(zhǔn)確. 2.該動(dòng)態(tài)激光散射裝置能夠測(cè)量純化蛋白的粒徑及其分布； 3.對(duì)純化蛋白的測(cè)量結(jié)果表明，粒徑越大，分子量越大；且在我們的測(cè)量范圍內(nèi)純化蛋白粒徑與分子量成指數(shù)單調(diào)遞增關(guān)系； 4.該技術(shù)有望成為分子生物學(xué)研究領(lǐng)域中的一項(xiàng)新的測(cè)量技