缺血后處理對缺血-再灌注損傷的修復及修復細胞來源的研究.pdf

1、目的：
　　 缺血后處理(lschemic Postconditioning，IPO)具有減輕缺血/再灌注(Ischemia/Reperfusion，I/R)損傷的作用。其保護作用的信號傳導機制，不僅能阻止細胞凋亡，還參與細胞周期的調控。本課題組已經證明IPO可以誘導心肌細胞增殖特異性指標5-溴脫氧尿嘧啶核苷(5-bromodeoxyuridine，BrdU)、磷酸化組蛋白H3(phosph-Histone H3，H3P)、Au

2、roraB的表達增加，初步證明IPO除能減少細胞凋亡外，還可以促進心肌細胞增殖補償受損的心肌細胞。本研究的目的是明確增殖細胞是來源于正常成熟心肌細胞還是多潛能干細胞。通過檢測多潛能干細胞表面特異性標記物c-kit、Gata-4、Mef2C，如果c-kit、Gata-4、Mef2C測定結果陽性，可以確定心肌組織內多潛能干細胞的存在，如果c-kit陽性、Gata-4、Mef2C陰性則為心肌肥大細胞。再通過免疫熒光技術檢測心肌橫紋肌肌動蛋白(

3、α-sarcomeric actin，α-SMA)確定成熟心肌細胞的數量，并與多潛能干細胞的數量進行相關性分析，推測心肌細胞增殖的可能來源。此外，通過五個時間點觀察c-kit蛋白的表達量，觀察干細胞數量隨時間變化的趨勢。
　　 方法：
　　 1.分組和模型的建立。雄性SD大鼠，體重250g-300g，分為三個處理組（假手術組、I/R組和IPO組），五個觀察時間點(1d、3d、7d、14d、30d)。假手術組（S組）：將大

4、鼠開胸左冠動脈下穿線不結扎；缺血/再灌注組(I/R)：大鼠開胸結扎左冠狀動脈30min，松開結扎線；缺血后處理組(IPO組)：大鼠開胸結扎左冠狀動脈30min后松開結扎，再灌注1Os，再缺血1Os，連續(xù)三個循環(huán)后松開結扎線。
　　 2、心肌細胞增殖指標的觀察。采用普通免疫組化SABC法定位觀察細胞增殖特異性指標5-溴脫氧尿嘧啶核苷(5-bromodeoxyuridine，BrdU)和橫紋肌肌動蛋白(α-sarcomeric ac

5、tin，α-SMA)，分析心肌細胞DNA合成。
　　 3、增殖細胞來源的證明。c-kit熒光免疫標記法定位觀察、western blot檢查其含量，RT-PCR分別檢測c-kit、Gata-4、Mef2C的表達。熒光免疫標記法觀察α-SMA，相關性分析c-kit和α-SMA的陽性細胞數量，確定最終細胞可能來源。
　　 4、通過血流動力學檢測，觀察IPO對受損大鼠心臟功能的保護作用。
　　 結果：
　　 1

6、、心肌細胞增殖的證明。免疫組化SABC法定位觀察BrdU。BrdU位于心肌細胞核，目標蛋白染色呈棕黃色為陽性細胞。結果顯示，棕黃色陽性目標蛋白顆粒在心肌組織呈散在分布，假手術組陽性細胞較少，I/R組和IPO組陽性細胞不同程度增多。BrdU在IPO組(PU值為：7.81±1.39);I/R組(PU值為：5.27±1.35)；假手術組(PU值為：4.39±1.22)。統(tǒng)計學分析結果顯示IPO組的PU值與假手術組比較，有顯著性差異(P＜0.0

7、5)。IPO組與I/R組比較、I/R組與假手術組比較均在數值上有提高，但無統(tǒng)計學意義。
　　 2、增殖細胞來源的證明。
　　 2.1.c-kit的檢測
　　 熒光免疫標記法結果顯示，在IPO組看到有c-kit陽性細胞，尤其3天數量較多(PU值為：2.91±0.29、5.39±0.42、4.37±0.35、3.02±0.67、2.14±0.25)，差異存在統(tǒng)計學意義(P＜0.05)：I/R組的c-kit陽性細胞集中

8、于7天(PU值為：1.29±0.12、2.64±0.274.71±0.59、2.85±0.27、1.71±0.38)，差異存在統(tǒng)計學意義（P＜0.05），其他處理組幾乎沒有看到c-kit陽性細胞。
　　 western blot結果進一步確定c-kit的蛋白水平的表達量在IPO組在3d最多，差異存在統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；I/R組也有相同趨勢，c-kit的蛋白表達水平在7d最多，且差異存在統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。其它兩組

9、處理組未見c-kit的表達。
　　 RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)IPO組和I/R組中，c-kit的表達量變化曲線與western blot基本相似，確定IPO組c-kit多潛能干細胞的表達量最大值出現(xiàn)在3d，I/R組出現(xiàn)在7d，且差異存在統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 2.2.RT-PCR檢測Gata-4和Mef2C的結果和c-kit的結果一致。
　　 2.3.干細胞和肥大細胞的區(qū)分。通過以上方法檢測多潛能干細胞表面

10、特異性標記物c-kit、Gata-4、Mef2C均為陽性，且表達量變化曲線基本一致，確定心肌組織內c-kit多潛能干細胞數量存在變化，而心臟肥大細胞數量變化不影響檢測結果。
　　 2.4.心肌細胞增殖的可能來源的推測。通過免疫熒光技術檢測α-SMA，確定成熟心肌細胞的數量，并與多潛能干細胞的數量進行相關性分析，得出兩者陽性細胞數量變化有關聯(lián)，推測心肌細胞增殖的可能來源為干細胞。
　　 3、IPO干預后可以改善大鼠心功能。

11、術后14d和30d血流動力學的變化：I/R組和IPO組LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmax均明顯低于假手術組，同時LVEDP明顯高于假手術組。與I/R組比較，IPO干預后不同時間LVSP及±dp/dtmax均明顯升高(p＜0.05)，而LVEDP雖有下降趨勢，但是這種變化各組時間點無統(tǒng)計學差異(p＞0.05)。
　　 結論：
　　 1、IPO和I/R兩種方法都可以引起心肌組織細胞數量增加，且這種增殖的細胞可能

12、來源為c-kit陽性的多潛能干細胞。
　　 2、IPO和I/R兩種方法引起c-kit陽性的多潛能干細胞增殖的高峰期不同，I/R在第7d，而IPO在第3d，且IPO較I/R能更快促使c-kit陽性的多潛能干細胞增殖。
　　 3、初步判斷c-kit陽性的多潛能干細胞數量的改變與成熟心肌細胞的數量改變有關，即在心肌受損后c-kit陽性的多潛能干細胞可能分化為成熟的心臟細胞以修復受損的心肌組織。
　　 4、IPO處理損傷