我國MSM人群HIV-1急性感染者中主要流行的CRF01-AE亞型毒株感染性分子克隆的構(gòu)建及其生物學(xué)特性研究.pdf

1、目的:
　　男男性接觸者(men who have sex with men，MSM)指與其他男性進(jìn)行性行為的男性，包括同性戀，雙性戀，異性戀和易性者。1981年，艾滋病首先在美國一組男同性戀者中被確認(rèn)。MSM成為世界上第一個被確認(rèn)的艾滋病高危人群。全球HIV監(jiān)測數(shù)據(jù)表明，近年來MSM人群的HIV-1感染率有上升趨勢。我國最新的艾滋病疫情報告也顯示，新發(fā)男男性接觸感染者連續(xù)幾年呈明顯上升趨勢，2011年4.8萬HIV-1新發(fā)感染中

2、，同性傳播占29.4％，MSM已成為新發(fā)感染數(shù)最大的高危人群。因此，目前最迫切的工作是加深對MSM人群HIV-1感染情況的了解，明確MSM人群中主要流行毒株及其流行規(guī)律，為有針對性的制定預(yù)防控制措施提供理論基礎(chǔ)。
　　多位學(xué)者的研究表明，56％-92％的新感染是由處在急性期的感染者傳播的;還有研究顯示，這些引起感染的毒株可能是被選擇出來傳播給新宿主的。對經(jīng)異性傳播HIV-1感染者的研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)生殖道粘膜屏障傳播的毒株存在明顯的傳播瓶

3、頸效應(yīng)，大多數(shù)建立有效的感染HIV-1傳播是由單一的Transmitted/Founderviruses（T/F毒株）引起的。因此，如果在病毒尚未廣泛擴(kuò)散及整合形成病毒潛伏庫時進(jìn)行有針對性的治療，建立感染的病毒和病毒感染的細(xì)胞是有可能被清除的。然而由于難以獲得感染早期病毒復(fù)制的粘膜部位標(biāo)本，目前對于這些引起HIV-1傳播和感染的T/F毒株的生物學(xué)特性和進(jìn)化的分子機(jī)制仍不清楚。而且，男性和女性在泌尿生殖道和直腸的解剖學(xué)和免疫組織學(xué)上存在較

4、大差異，使得上述對異性傳播感染者實驗得到的結(jié)果并不完全適用于解釋MSM中傳播的T/F毒株的特征及在HIV-1傳播和建立持續(xù)感染中的作用。此外，由于HIV-1具有眾多亞型，病毒基因組序列高度多樣化;而且通過不同途徑傳播的T/F毒株在基因型和表現(xiàn)型方面存在明顯的差異。因此，為了尋找更好地控制HIV-1在MSM人群中的傳播蔓延并改善臨床預(yù)后的方法，就需要進(jìn)一步深入開展MSM人群HIV-1主要流行的T/F毒株的生物學(xué)特征及致病機(jī)理等基礎(chǔ)研究。<

5、br>　　由于HIV感染缺乏理想的動物模型，HIV的體外感染性分子模型即感染性分子克隆成為不可或缺的一種重要研究工具，也為開展該病毒的分子致病機(jī)理、基因組結(jié)構(gòu)與功能等基礎(chǔ)應(yīng)用研究提供了前提條件。但目前世界上現(xiàn)有的感染性分子克隆大都是利用歐美和非洲國家的B和C亞型毒株構(gòu)建而成，并不適用針對中國HIV-1主要流行毒株的研究。
　　目前，我國對MSM人群中HIV-1感染者的研究主要為HIV-1感染率及社會學(xué)和行為學(xué)的調(diào)查，僅有數(shù)篇小樣本

6、MSM人群HIV-1感染者的病毒亞型分析的報道，而關(guān)于該人群HIV-1感染主要流行株的遺傳學(xué)和病毒學(xué)特性的信息較少。我國至今僅有來源于既往有償獻(xiàn)血員中流行的B啞型以及IDUs感染者中流行的CRF07_BC和CRF08_BC亞型的感染性分子克隆，尚未見目前新發(fā)感染數(shù)最大的高危人群MSM中主要流行毒株感染性分子克隆的相關(guān)報道，更無其早期傳播毒株感染性分子克隆的報道。
　　綜上所述，本研究在全國第二大MSM聚集地的遼寧省，對MSM中的H

7、IV-1感染者進(jìn)行分子流行病學(xué)調(diào)查，明確在我國MSM中主要流行的病毒亞型，并選取其中有代表性的早期傳播毒株分離其原代病毒株，并進(jìn)行感染性分子克隆的構(gòu)建，借助此感染性分子克隆對MSM中主要流行毒株進(jìn)行生物學(xué)特性研究，為探討MSM中HIV-1快速傳播的機(jī)制以及研發(fā)有效的抗病毒藥物和疫苗等方面的研究提供良好的技術(shù)平臺。
　　方法:
　　一、研究對象
　　229名經(jīng)男男性接觸感染HIV-1的成年（18歲以上）男性。征得患者的知

8、情同意后進(jìn)行面對面問卷調(diào)查采集相關(guān)流行病學(xué)信息，所有病例均否認(rèn)靜脈吸毒史和賣/輸血史，在采集血樣時均未接受任何抗艾滋病毒治療;采集EDTA抗凝外周靜脈血，6小時內(nèi)常規(guī)離心，分離血漿，分裝后-80℃低溫保存。
　　二、實驗方法
　?。ㄒ唬┎《竞怂崽崛?br>　　以140μl血漿按照QIAamp Viral RNA Mini Kit說明書步驟提取病毒基因組 RNA。以1×106個細(xì)胞按照QIAamp DNA Blood Mini

9、 Kit說明書步驟提取前病毒基因組DNA。
　?。ǘ㏄CR擴(kuò)增、產(chǎn)物純化及基因序列測定
　　使用反轉(zhuǎn)錄PCR和套式PCR方法，分別擴(kuò)增pol基因(nt2252-3299，蛋白酶1-99密碼子和反轉(zhuǎn)錄酶1-250密碼子)和env基因(nt7011-7715，C2-V5)。PCR產(chǎn)物純化參照QIAquick Gel Extraction Kit操作步驟。利用測序引物進(jìn)行測序反應(yīng)，純化后上機(jī)檢測。
　?。ㄈ┬蛄蟹治?br

10、>　　采用BioEdit軟件對測序結(jié)果進(jìn)行編輯處理，然后進(jìn)行拼接。用Mega5.0軟件自展法(bootstrap)重復(fù)運(yùn)算1000次構(gòu)建Neighbor-Joining(NJ)進(jìn)化樹。利用Mega軟件中的distance程序中的Kimura雙參數(shù)方法計算序列間的基因離散率。用HIVDatabase中VESPA軟件分析兩個流行簇毒株遺傳變異特征;Highlighter軟件對序列進(jìn)行比較，并標(biāo)記出匹配/不匹配、有義/無義突變及超突變等特征。

11、用Geno2pheno軟件預(yù)測對病毒的輔助受體使用情況。
　　（四）病毒載量測定
　　以1ml血漿采用標(biāo)準(zhǔn)版模板制備法提取RNA，使用COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-12.0(ROCHE)以TaqMan RT-PCR方法測定病毒載量。
　?。ㄎ澹?HIV-1抗體檢測
　　1、ELISA法
　　使用法國生物梅里埃公司第三代檢測試劑盒，參照試劑盒說明書進(jìn)行檢測。
　　2、

12、WB法
　　使用新加坡MP生物醫(yī)學(xué)亞太私人有限公司人類免疫缺陷病毒(HIV1+2型)抗體檢測試劑盒，參照試劑盒說明書進(jìn)行檢測。
　?。㏒GA法擴(kuò)增近全長序列及基因序列測定
　　使用反轉(zhuǎn)錄PCR和套式PCR方法，分別擴(kuò)增5'amplicon(nt634-5066)和3'amplicon(nt4900-9612)。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳確定有目的條帶的PCR產(chǎn)物送至華大基因科技有限公司（北京）進(jìn)行walking sequen

13、cing。
　?。ㄆ撸U(kuò)增全長序列及基因序列測定
　　使用套式PCR方法，分別擴(kuò)增5'half genome(nt1-5066)和3'half genome(nt4900-9719)。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳確定有目的條帶的PCR產(chǎn)物送至華大基因科技有限公司（北京）進(jìn)行walking sequencing。
　?。ò耍┓肿涌寺?br>　　1、半分子克隆
　　參照TOPOXL PCR CloningKit說明書，純化PCR

14、產(chǎn)物后，進(jìn)行TOPO克隆反應(yīng)和化學(xué)轉(zhuǎn)化，構(gòu)建半分子克隆。
　　2、質(zhì)粒提取及基因序列測定
　　參照QIAprep Spin Miniprep Kit說明書提取半分子克隆的質(zhì)粒DAN;進(jìn)行酶切、電泳鑒定。經(jīng)鑒定已插入目的片段的半分子克隆送至華大基因科技有限公司（北京）進(jìn)行walking sequencing。
　　3、全基因組克隆及基因序列測定
　　分別將5'和3'半分子克隆用NdeⅠ和NotⅠ雙酶切并純化后，分別

15、回收8.5kb和5kb片段;在T4DNA連接酶作用下，于4℃連接過夜;經(jīng)酶切和電泳鑒定已插入目的片段的全基因組克隆送至華大基因科技有限公司（北京）進(jìn)行walkingsequencing。
　?。ň牛┵|(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)染
　　參照Fugene6 Transfection Reagent說明書將全基因組克隆轉(zhuǎn)入293T細(xì)胞;37℃，5％CO2條件下培養(yǎng)48小時，取200μl上清進(jìn)行HIV-1 p24抗原檢測，2ml凍存于-156℃。

16、
　?。ㄊ￤B法檢測轉(zhuǎn)染后的293T細(xì)胞中的蛋白表達(dá)情況
　　參照《分子克隆》提取轉(zhuǎn)染后293T細(xì)胞的蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)至PVDF膜，分別與一抗和二抗封閉作用后，參照ECL顯色試劑盒說明書進(jìn)行檢測。
　?。ㄊ唬〩IV-1病毒分離
　　利用密度梯度離心法分離正常人和HIV-1感染者的PBMC;采用PBMC共培養(yǎng)法復(fù)制病毒。每3-4天換液1次，每7天添加1次經(jīng)PHA刺激生長3天的正常淋巴細(xì)胞。定期

17、對培養(yǎng)細(xì)胞上清中的HIV-1p24抗原含量進(jìn)行檢測。
　?。ㄊ唬〩IV-1病毒生物學(xué)特性研究
　　利用TZM-b1細(xì)胞檢測病毒感染性，利用PBMC檢測病毒復(fù)制能力，利用GHOST-CD4-CXCR4/CCR5細(xì)胞檢測病毒輔助受體利用情況。
　?。ㄊ〩IV-1 p24抗原檢測
　　參照美國Zeptometrix公司HIV-1 p24抗原定量檢測試劑盒說明書進(jìn)行檢測。
　?。ㄊ┙y(tǒng)計學(xué)處理
　　本

18、研究涉及統(tǒng)計分析和相關(guān)性分析均采用spss18.0軟件包處理。
　　結(jié)果:
　　一、MSM人群中流行的HIV-1主要基因型及其特征研究
　?。ㄒ唬┻|寧省MSM人群HIV-1感染者基因亞型分布及與全國流行毒株的關(guān)系
　　利用NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹綜合分析pol和env基因序列，發(fā)現(xiàn)我省MSM人群HIV-1感染者中存在CRF01_ AE、B/B'、CRF07_BC3種亞型。其中CRF01_AE亞型占85.6％(196/229

19、)，B/B'亞型占9.6％(22/229)，CRF07_BC占3.5％(8/220)。其中CRF01_AE亞型毒株主要分為兩簇，cluster1毒株與我國其他地區(qū)MSM中流行毒株聚集成簇，推測其與我國MSM中廣泛流行毒株具有更近的遺傳親緣關(guān)系;cluster2毒株雖人數(shù)眾多，但組內(nèi)基因距離較小，同源性較高，且與我省經(jīng)異性傳播毒株距離較近，提示可能經(jīng)異性接觸傳入，由奠基者效應(yīng)引起在遼寧省內(nèi)MSM人群的擴(kuò)散傳播。
　?。ǘ┻|寧省MS

20、M人群HIV-1感染者基因亞型分布的歷年演變情況
　　2000-2010每年新確診病例中CRF01_ AE亞型均占72.0％以上，為遼寧省MSM人群主要的HIV-1流行毒株。其中cluster1上升趨勢顯著，而cluster2自2008年開始下降。相同的趨勢也出現(xiàn)在2009年和2010年新發(fā)現(xiàn)的急性HIV-1感染者中。因此，推測雖然cluster2毒株在遼寧省MSM中感染者存在一定的奠基者效應(yīng)，而cluster1毒株近年來增加較快

21、，值得關(guān)注。
　?。ㄈ┻|寧省MSM人群HIV-1感染者中流行的CRF01 AE毒株V3區(qū)氨基酸特征
　　V3區(qū)頂端四肽是最重要的中和抗體決定簇，cluster1毒株主要表現(xiàn)為GPGQ而cluster2毒株主要為GPGR，兩者存在顯著性差異。經(jīng)比較cluster1和cluster2毒株在輔助受體利用情況上無差異，均以CCR5作為輔助受體為主。cluster1和cluster2毒株在V3區(qū)的氨基酸序列主要存在4個特征性氨基酸位

22、點，分別位于第13、18、19和32位。其中第18位氨基酸位于頂端四肽，第13、18和19位氨基酸存在電荷差異，主要表現(xiàn)為cluster1為帶正電荷，而cluster2為帶負(fù)電荷。這些氨基酸電荷的差異會引起蛋白空間構(gòu)象的不同，從而直接影響病毒的生物學(xué)性質(zhì)。與我國其他地區(qū)MSM中流行的CRF01_ AE亞型毒株比較后發(fā)現(xiàn)，cluster1毒株與其在這幾個位點上的特征性氨基酸組成更為類似。因此，推測cluster1和cluster2毒株可能

23、具有不同的生物學(xué)特性，而cluster1毒株與國內(nèi)其他地區(qū)MSM中流行的毒株有更相似的生物學(xué)特征。
　　二、MSM中HIV-1急性感染者代表性病毒株的選取及其病毒生物學(xué)特性研究
　?。ㄒ唬┐硇远局甑倪x擇
　　選取cluster1中的急性感染者為研究對象。結(jié)合病毒RNA、抗體WB檢測結(jié)果及流行病學(xué)資料，對基因序列分析后，選擇資料完整的患者320008為研究對象進(jìn)行下一步驗證。獲得其感染第30天（第一點，F(xiàn)iebigⅣ期

24、，僅有血漿樣本）、第47天（第二點，F(xiàn)iebigⅥ期，保留血漿和PBMC樣本）和第54天（第三點，F(xiàn)iebigⅥ期，保留血漿和PBMC樣本）血漿病毒RNA進(jìn)行近全長序列擴(kuò)增。比較后發(fā)現(xiàn)在第二、三點與第一點高度相似，但存在3個可遺傳的有義突變，分別位于gag基因p17末端(423)，tat基因第一外顯子末端(70)，env基因C4起始位置(2)，而且第二點與第三點病毒相比擁有較少的G-＞A超突變和gag區(qū)的變異，意味著第三點病毒受宿主免疫

25、壓力的影響較大，從而推測第二點病毒應(yīng)是更接近建立感染的早期傳播毒株。
　　利用SGA方法擴(kuò)增第二點樣本的近全長序列，分別比較其5'和3'amplicon的序列后發(fā)現(xiàn)，序列間核苷酸變異率較小，組內(nèi)遺傳距離均為0.001±0.000。由此可知，第二點5'和3'SGA amplicon的遺傳同質(zhì)性均較高，因此推斷第二點病毒還是單一的毒株，受宿主免疫壓力影響較小，仍具有建立感染的早期傳播毒株的特征;且與現(xiàn)有CRF01_ AE亞型感染性分子

26、克隆的基因距離較遠(yuǎn)，推測這些感染性分子克隆與我國MSM人群中流行的CRF01 AE亞型的早期傳播毒株在某些生物學(xué)特性上可能會存在差異，并不適用于研究我國MSM人群的HIV-1主要流行毒株的生物學(xué)特征及致病機(jī)理等基礎(chǔ)研究。
　?。ǘ┰缙趥鞑ザ局暝《镜姆蛛x及其病毒生物學(xué)特性
　　利用PBMC共培養(yǎng)法，我們成功分離了前期選取的患者320008感染第47天的原代病毒08-ISO，其能感染TZM-b1和PBMC細(xì)胞，并可在其中復(fù)

27、制，且復(fù)制水平較高，以CCR5作為輔助受體，具有巨噬細(xì)胞嗜性的特性，是具有早期傳播毒株表型特征的原代病毒。綜上，我們獲得了一株具有高度遺傳同質(zhì)性、有感染和傳播能力的代表性毒株，其在基因型和表型上都具備早期傳播毒株的特征。
　　三、CRF01-AE亞型HIV-1早期傳播毒株感染性分子克隆的構(gòu)建及其生物學(xué)特征的初步研究
　　（一）320008毒株全基因組克隆的構(gòu)建與鑒定
　　320008原代病毒(08-ISO)體外培養(yǎng)后，

28、提取前病毒基因組DNA，兩段法分別擴(kuò)增5'半分子(5'LTR-vif,1-5066nt)和3'半分子(vif-3'LTR，4900-9719nt)后，分別克隆入TOPO PCR-XL載體構(gòu)建成半分子克隆，再利用NdeⅠ酶切位點連接為全基因組克隆。其基因序列結(jié)果顯示，全基因組克隆包括完整的HIV-1結(jié)構(gòu)，且無移碼突變和終止密碼。經(jīng)NJ系統(tǒng)樹分析表明，其與病毒RNA近全長的共享序列高度同源，且與前期研究中CRF01 AE cluster1中

29、毒株聚集成簇，遠(yuǎn)離現(xiàn)有的來源于慢性經(jīng)異性傳播CRF01 AE亞型感染者的感染性分子克隆。
　?。ǘ?20008衍生病毒的產(chǎn)生及其HIV-1主要結(jié)構(gòu)蛋白的表達(dá)情況
　　全基因組克隆轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞48小時后，收集上清檢測其HIV-1 p24抗原，均在1×105 pg/ml以上，說明有衍生病毒產(chǎn)生。利用Western Blotting技術(shù)檢測轉(zhuǎn)染后的293T細(xì)胞，其結(jié)果顯示有g(shù)p160，gp120，gp41，p64，p53，p

30、24和p17等蛋白表達(dá)，提示我們構(gòu)建的全基因組克隆可以在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄并翻譯出HIV-1的結(jié)構(gòu)和功能蛋白，并被細(xì)胞蛋白酶很好地切割，具備了組裝HIV-1_病毒顆粒的條件，是具有感染性的全基因組克隆即感染性分子克隆(08-IMC)。
　?。ㄈ└腥拘苑肿涌寺∩飳W(xué)特性的研究
　　感染性分子克隆(08-IMC)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后，收獲的衍生病毒能感染TZM-b1和PBMC細(xì)胞，并可在其中復(fù)制，但衍生病毒的復(fù)制水平顯著低于其原代病毒(

31、08-ISO);與原代病毒(08-ISO)的情況一致，衍生病毒也以R5作為輔助受體，具有巨噬細(xì)胞嗜性的特性，。因此，我們獲得的感染性分子克隆(08-IMC)也具有早期傳播毒株的特征。
　　結(jié)論:
　　1.CRF01 AE是遼寧省MSM人群中主要流行的HIV-1亞型，主要分為兩大簇，其中近年來增加較快的cluster1與cluster2在V3區(qū)氨基酸特征上存在顯著差異，而與我國其他地區(qū)MSM中流行的毒株相似，基因距離較近，具有

32、較近的親緣關(guān)系。
　　2.篩選cluster1毒株，選取一例感染47天處于FiebigⅥ期的感染者320008分離其原代病毒08-ISO并檢測其病毒生物學(xué)特性，結(jié)果顯示其病毒RNA具有較高的遺傳同質(zhì)性，是早期感染的單一毒株;原代病毒08-ISO可以利用CCR5輔助受體感染TZM-b1細(xì)胞和PBMC，并可在其中復(fù)制，且復(fù)制水平較高。由此可以確定原代病毒08-ISO是目前在我國MSM人群中主要流行的CRF01_AE亞型毒株中具有代表性