支持細胞模擬生物微環(huán)境對人臍帶華爾通氏膠源間充質干細胞分化成男性生殖細胞的影響.pdf

1、【背景與目的】不孕不育影響越來越多的夫婦，現越來越多的臨床證據顯示不育的原因來自男性，大約占50％，這其中又有70%～90%是源于精子發(fā)生出現障礙，臨床表現為精子產生異常。生殖細胞缺陷所致的男性不育癥是目前臨床難于攻克的疾病，傳統(tǒng)輔助生殖技術尚無法從根本上解決此類病人的生育問題，精原干細胞移植是突破這一瓶頸的理想途徑。人臍帶華爾通氏膠來源的間充質干細胞有很強的自我更新能力和多向分化潛能，能向三個胚層的細胞分化，人臍帶間充質干細胞是人類的

2、再生醫(yī)學工程上的種子細胞。我們的前期研究表明，人臍帶間充質干細胞在新生小鼠睪丸細胞培養(yǎng)液、維甲酸及睪酮的誘導培養(yǎng)下，誘導第7天形態(tài)上開始變細變長，形成類似“蝌蚪樣”細胞，第3、7天表達生殖細胞標記Oct4、Ckit、CD49f、Stella，第14天表達生殖細胞特異標記Vasa；人臍帶間充質干細胞移植至不育小鼠睪丸體內，1個月后表達生殖細胞標記Stella、Dazl，并且移植到不育小鼠體內不發(fā)生排斥反應，且可發(fā)生遷移并能存活至少120天

3、。但是誘導得到的細胞無法進一步誘導分化成為有功能的成熟的男性生殖細胞，而且全反式維甲酸、睪酮是人造的化學藥物添加劑。近幾年來，越來越多的證據顯示干細胞的定向分化與其所處微環(huán)境中的信號通路有關，環(huán)境中的信號調節(jié)系統(tǒng)通過與基因簇相互作用，決定了特定基因的表達。微環(huán)境中的信號很多，可以概括為兩類：一是化學信號分子，一是物理信號。據文獻報道，在干細胞的定向分化研究發(fā)現，細胞間的相互接觸是一關鍵因素，為干細胞分化提供電、機械刺激及各種化學信號分子

4、。睪丸支持細胞對于男性生殖細胞的發(fā)生、成熟有著至關重要的作用。于是我們提出了這樣一個設想：人臍帶間充質干細胞與睪丸支持細胞間的互相作用可能可以誘導人臍帶間充質干細胞獲得男性生殖細胞的特性，體外分離培養(yǎng)睪丸支持細胞作為飼養(yǎng)層，模擬男性睪丸微環(huán)境誘導，提供人臍帶間充質干細胞定向分化所需的細胞因子、營養(yǎng)成分等，對人臍帶間充質干細胞在支持細胞是否存在“環(huán)境依賴性分化”的特性，以及生物誘導分化的效果進行研究。
　　【材料與方法】采用差異貼壁

5、法分離、培養(yǎng)、擴增出人臍帶間充質干細胞，從新生昆明小鼠的睪丸中分離培養(yǎng)出睪丸支持細胞，制備支持細胞飼養(yǎng)層，將人臍帶間充質干細胞加入支持細胞飼養(yǎng)層中共培養(yǎng)，顯微鏡觀察誘導前后細胞的形態(tài)學變化；RT-PCR、細胞免疫熒光、westblot檢測男性生殖細胞相關標記的表達。
　　【結果】模擬一種有效的“睪丸微環(huán)境”對人臍帶間充質干細胞進行誘導，利用人臍帶間充質干細胞與睪丸支持細胞飼養(yǎng)層直接接觸，隨著共培養(yǎng)后，人臍帶間充質干細胞逐漸失去細小

6、成纖維樣的形狀，形成類似精原細胞樣的圓形細胞菌落，圓形緊密團簇精原細胞樣在28天后形成，誘導7天、14天、21天后，RT-PCR、細胞免疫熒光、westblot均可以檢測到男性生殖細胞特異性標記VASA、DAZL及stella的表達。
　　【結論】在睪丸支持細胞模擬的睪丸微環(huán)境，人臍帶間充質干細胞不僅發(fā)生形態(tài)學的變化，而且能表達生殖細胞的特異生物學特性，表明在特定的微環(huán)境中，細胞與細胞間的相互接觸是微環(huán)境中控制人臍帶間充質干細胞向