90K-MaC-2 BP在人腦膠質(zhì)星形細(xì)胞瘤中的表達(dá)以及90K-Mac002 BP負(fù)載的樹突狀細(xì)胞疫苗抗膠質(zhì)瘤的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分、90K/Mac-2 BP在人腦星型細(xì)胞瘤中的表達(dá)
　　目的:分析90K/Mac-2 BP(Mac-2 binding protein)在人腦星型細(xì)胞瘤中的表達(dá)。
　　方法:RT-PCR檢測(cè)90K mRNA在人腦星型細(xì)胞瘤以及正常腦組織中的表達(dá);采用WB(Western blot)和免疫組化檢測(cè)90K蛋白在人腦星型細(xì)胞瘤以及正常腦組織中的表達(dá)。
　　結(jié)果:RT-PCR發(fā)現(xiàn)90K mRNA在正常腦組織中微量表達(dá)，

2、相對(duì)表達(dá)量為0.116±0.017;而在人腦星型細(xì)胞瘤中高表達(dá)，相對(duì)表達(dá)量為0.407±0.151，與正常腦組織相比有顯著差異(t=6.065，P＜0.05)。低級(jí)別星型細(xì)胞瘤（WHOⅠ-Ⅱ級(jí)）與高級(jí)別星型細(xì)胞瘤(WHOⅢ-Ⅳ級(jí))相對(duì)表達(dá)量分別為0.295±0.067和0.516±0.128，兩組相比有顯著差異(t=8.138，P＜0.05)。90K mRNA的表達(dá)與患者的性別、年齡以及腫瘤大小沒有顯著相關(guān)關(guān)系(P＞0.05)。West

3、ern blot結(jié)果顯示在正常腦組織有少量的90K蛋白表達(dá)，而在星型細(xì)胞瘤中表達(dá)則顯著升高。正常腦組織中90K蛋白相對(duì)表達(dá)量（90K IOD值/GAPDHIOD值）為0.291±0.064，星型細(xì)胞瘤中90K蛋白相對(duì)表達(dá)量為1.163±0.391，兩組相比有顯著差異(t=15.68，P＜0.05)。低級(jí)別星型細(xì)胞瘤中90K蛋白相對(duì)表達(dá)量為0.902±0.272，高級(jí)別星型細(xì)胞瘤中90K蛋白相對(duì)表達(dá)量為1.415±0.318，兩組相比有顯

4、著差異(t=6.539，P＜0.05)。Western blot結(jié)果顯示90K蛋白的表達(dá)與患者的性別、年齡以及腫瘤大小沒有顯著相關(guān)關(guān)系(P＞0.05)。免疫組化結(jié)果顯示正常腦組織90K蛋白表達(dá)陽性率為10％(1/10)，星形細(xì)胞瘤90K蛋白表達(dá)陽性率為70.18％(40/57)，兩組相比有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。低級(jí)別星型細(xì)胞瘤中90K蛋白表達(dá)陽性率為53.57％(15/28)，高級(jí)別星型細(xì)胞瘤中90K蛋白表達(dá)陽性率為86.2

5、1％(25/29)，兩組相比有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。免疫組化結(jié)果顯示90K蛋白的表達(dá)與患者的性別、年齡以及腫瘤大小沒有顯著相關(guān)關(guān)系(P＞0.05)。Spearman秩相關(guān)檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，90K蛋白的表達(dá)水平隨著星型細(xì)胞瘤級(jí)別的升高而升高(r=0.786，P＜0.01)。
　　結(jié)論:90K mRNA與90K蛋白均在星形細(xì)胞瘤組織中高表達(dá)，在正常腦組織中微量表達(dá);90K蛋白的表達(dá)水平與星形細(xì)胞瘤的惡性程度正相關(guān);90K可能在星型

6、細(xì)胞瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮了重要作用。90K蛋白是星形細(xì)胞瘤相關(guān)抗原，在今后星形細(xì)胞瘤的免疫治療中可能成為特異性的目標(biāo)抗原。
　　第二部分、90K/Mac-2 BP負(fù)載的樹突狀細(xì)胞疫苗抗人腦星型細(xì)胞瘤的實(shí)驗(yàn)研究
　　目的:分析90K蛋白在DC疫苗抗星形細(xì)胞瘤免疫治療中的作用。
　　方法:WB法檢測(cè)90K蛋白在U251細(xì)胞中的表達(dá);采用人外周血單核細(xì)胞分化培養(yǎng)DC;采用熱凋亡法制備U251凋亡細(xì)胞，并與90K蛋白一起負(fù)載

7、DC制備腫瘤疫苗;采用ELISA檢測(cè)抗原負(fù)載DC和T淋巴細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子;免疫磁珠法分選CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞;CCK-8法檢測(cè)抗原負(fù)載DC誘導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)和CTL對(duì)U251細(xì)胞的殺傷作用。實(shí)驗(yàn)中抗原負(fù)載DC分為四組:未成熟DC組，成熟DC組，凋亡U251細(xì)胞-DC組和凋亡U251細(xì)胞+90K-DC組。
　　結(jié)果:WB法檢測(cè)90K蛋白在U251細(xì)胞中的表達(dá)升高。培養(yǎng)成熟的DC在光鏡和電鏡下具有典型的樹突樣結(jié)構(gòu)，流

8、式細(xì)胞儀檢測(cè)其細(xì)胞表面高表達(dá)CD80、CD86和HLA-DR。在44℃下加熱3小時(shí)的U251細(xì)胞凋亡率最高，與DC細(xì)胞融合良好。四組DC疫苗中凋亡U251細(xì)胞+90K-DC分泌的IL-12p70濃度最高，而IL-10的濃度要稍低。抗原負(fù)載DC能夠刺激T淋巴細(xì)胞增殖，四組中凋亡U251細(xì)胞+90K-DC組刺激T淋巴細(xì)胞增殖能力最強(qiáng)。免疫磁珠法分選的CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞具有很高的細(xì)胞純度。抗原負(fù)載DC能夠刺激CD4+T細(xì)胞分化為T

9、h1細(xì)胞并分泌IFN-γ，四組中凋亡U251細(xì)胞+90K-DC組刺激CD4+T細(xì)胞分化為Th1細(xì)胞并分泌IFN-γ的濃度最高?？乖?fù)載DC能夠刺激CD8+T細(xì)胞活化為CTL細(xì)胞并分泌IFN-γ，四組中凋亡U251細(xì)胞+90K-DC組刺激CD8+T細(xì)胞活化為CTL細(xì)胞并分泌IFN-γ的濃度最高?？乖?fù)載DC刺激CD8+T細(xì)胞活化為CTL后具有殺傷U251細(xì)胞作用，四組中凋亡U251細(xì)胞+90K-DC組刺激CD8+T細(xì)胞活化為CTL細(xì)胞殺傷

10、U251細(xì)胞的作用最強(qiáng)。
　　結(jié)論:經(jīng)過人外周靜脈血中單核細(xì)胞分化而來的DC具有典型的形態(tài)特征和免疫表型，可為制備DC腫瘤疫苗提供可靠穩(wěn)定的DC細(xì)胞來源。經(jīng)過熱凋亡U251細(xì)胞和90K蛋白共同負(fù)載的DC在體外能夠誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞的增殖。免疫磁珠法分選的CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞具有很高的細(xì)胞純度。熱凋亡U251細(xì)胞和90K蛋白共同負(fù)載的DC疫苗能夠誘導(dǎo)抗原特異性CTL殺傷U251細(xì)胞，其殺傷U251細(xì)胞的作用比單獨(dú)應(yīng)用熱凋亡U2