核酸基礎(chǔ)序列擴增即刻早期核糖核酸在腎移植術(shù)后巨細胞病毒感染中的應用研究.pdf

1、自從1954年首次成功在孿生子問進行腎移植以來，經(jīng)過半個世紀的不懈努力，腎移植技術(shù)已從探索走向成熟。近年來，由于技術(shù)的改進，對免疫學認識的深入以及強有力免疫抑制劑的問世，患者的近中期生存率及生活質(zhì)量已有極大的改善，1年尸腎存活率已達96％，5年腎存活率達80％。但是器官移植后受者的人類巨細胞病毒(Humancytomegalovirus,HCMV)感染仍然是導致移植后患者死亡的主要原因之一。移植術(shù)后CMV肺部感染發(fā)生率為20％～70％，

2、且15％～35％為有癥狀的CMV病，典型的CMV肺部感染多發(fā)生于移植術(shù)后1～6個月內(nèi)。CMV在全世界成人中感染率為60％～100％，多為潛伏性感染，機體表現(xiàn)為持續(xù)血清學陽性(即抗CMV抗體IgG陽性)。當免疫功能下降、特別是細胞免疫力低下時，機體又可新感染CMV，或潛伏的病毒再次激活、復制，形成活動性CMV感染，重者則發(fā)生明顯的“CMV病”，在這種情況下，CMV常與其他病原體使免疫功能低下者發(fā)生二重或多重感染，病情兇險，死亡率高。CMV

3、肺部感染被認為不僅是器官移植術(shù)后近期死亡的重要原因，而且還可能與急性排斥反應和慢性移植物失功有關(guān)。如能早期診斷活動性CMV感染，并及時給予抗病毒治療可有效改善免疫受抑制和免疫缺陷病人活動性HCMV感染的癥狀，降低其疾病的嚴重性和死亡率。因此，在監(jiān)測CMV易感病人時，應及早而準確地把握病人是否發(fā)生活動性HCMV感染，這樣才能及時治療活動性感染的病人，又使未發(fā)生活動性感染的病人免受抗病毒藥的毒性損害。 第一部分建立NASBBA法檢測

4、即刻早期核糖核酸的實驗條件及在器官移植后巨細胞病毒感染診斷中的初步實驗研究 目的：器官移植術(shù)后CMV感染是導致移植后患者死亡的主要原因之一，因而早期、快速而準確地診斷CMV活動性感染已成為監(jiān)測CMV感染狀況、及時給予抗病毒治療以及判斷預后的關(guān)鍵。關(guān)于CMV的診斷方法很多，如病毒包涵體檢查、病毒分離培養(yǎng)、血清抗體檢測及DNA聚合酶反應(PCR)、CMV抗原血癥的檢測等，這些方法各有優(yōu)缺點，但是存在一個共同的不足之處，即無法區(qū)分CM

5、V潛伏性感染和活動性感染。隨著對CMV基因組的結(jié)構(gòu)和功能的深入研究，有學者發(fā)現(xiàn)即刻早期和晚期基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物和病毒復制緊密相連，由此提出檢測病毒mRNA是快速診斷CMV活動性感染的一項黃金指標。近年來，應用核酸基礎(chǔ)序列擴增(Nucleicacidsequence-basedamplification，NASBA)技術(shù)檢測病毒RNA得到了快速發(fā)展。NASBA法檢測RNA是一項引物依賴性的核酸技術(shù)，我院自2000年1月始采用該法測定pp67-

6、mRNA用于移植術(shù)后CMV活動性感染的臨床診斷，取得了許多經(jīng)驗，pp67-mRNA檢測雖然特異性高，但敏感度低，而且陽性結(jié)果出現(xiàn)時間較晚等缺點，不能滿足臨床的需要。為了尋求更好的檢測指標，于2004年1月，我們建立了應用NASBA法檢測即刻早期核糖核酸(Immediate-earlymRNA，IE-mRNA)的實驗條件，結(jié)合臨床實際，并與pp67和抗原血癥檢測相比較。 方法：病例為我院2004年1月～2004年6月接受器官移植的

7、患者，共42例，腎移植25例，肝移植13例，骨髓移植4例。術(shù)后每周抽抗凝血一次至術(shù)后3個月。首先建立NASBA法檢測lE-mRNA的實驗條件及相關(guān)試劑的合成。采用NASBA法檢測IE-mRNA、pp67-mRNA，同時進行免疫組化EnvisionTM二步法檢測pp65抗原血癥。所有患者均采用Pred+MMF+CsA\FK506三聯(lián)免疫抑制治療。術(shù)后采用普遍性預防抗病毒治療方案，給予丙氧鳥苷2.5～5mg·kg-1·d-1，分2次靜脈滴注

8、，共2周。如患者發(fā)生CMV病則丙氧鳥苷劑量加倍。20例健康成人的血標本作為陰性對照。 結(jié)果：42例器官移植術(shù)后患者共收集了134份外周血標本，分別進行了pp65抗原、pp67-mRNA及IE-mRNA的檢測，有2份標本擴增野生型mRNA及SC-mRNA失敗，視為無效，有效標本數(shù)實為132份。36份抗原血癥陽性(≥1個/5萬PMNL)標本中有25份IE-mRNA同時陽性，陽性符合率為69.4％；13份pp67-mRNA陽性標本中有

9、11份IE-mRNA陽性，陽性符合率為84.6％。42例移植術(shù)后患者中，檢出pp65抗原陽性(≥1個/5萬PMNL)25例(陽性檢出率59.5％)，pp67-mRNA陽性11例(陽性檢出率26.2％)，IE-mRNA陽性16例(陽性檢出率38.1％)。發(fā)生有癥狀的活動性CMV感染(CMV病)11例，其中抗原陽性8例，pp67-mRNA陽性6例，IE-mRNA陽性10例。IE-mRNA的敏感度、特異度、陽性預測值及陰性預測值分別為90.9

10、％、80.6％、62.5％和96.1％。 結(jié)論：(1)NASBA法檢測CMV-mRNA具有便捷、快速、準確可靠的優(yōu)點，特異性高，假陽性率低。(2)pp67-mRNA的檢出對疾病診斷具有高的特異性，但敏感度低，不適于作為移植后先發(fā)制人抗病毒治療方案的依據(jù)，可以作為一個判斷預后的指標。(3)IE-mRNA的檢測具有較理想的敏感性和特異度，IE-mRNA能夠更好的反映CMV活動性感染的狀況，是病毒活動性感染的早期診斷指標。 第

11、二部分NASBA法檢測即刻早期核糖核酸在腎移植后巨細胞病毒感染診斷和指導治療中的意義研究 目的：目前腎移植后抗CMV病的重點是預防，包括普遍性預防抗病毒治療和先發(fā)制人(Pre-emptivetherapy)治療。普遍性預防治療會給患者帶來沉重的經(jīng)濟負擔和加重的藥物毒性問題，先發(fā)制人的抗病毒治療方案，可以減少治療的費用與藥物毒性而又不會延誤治療，早期檢測到活動性CMV感染是先發(fā)制人方案的先決條件。為了準確地把握好臨床的用藥時機，準

12、確地開始和終止用藥，減少不必要的經(jīng)濟損失和藥物毒負作用等，這就要求實驗室的檢測能夠早期、快速、準確可靠反映HCMV的活動狀況，同時能夠動態(tài)地檢測CMV在受者體內(nèi)的活動變化。在此前提下，我們對腎移植術(shù)后55例患者的CMVlE-mRNA、pp67-mRNA、pp65抗原以及血清學抗體進行了動態(tài)檢測，結(jié)合抗病毒治療，尋找一種可用于先發(fā)制人抗病毒治療方案的最佳指標。 方法：病例選自我院接受腎移植的患者，共55例，術(shù)前所有供者和受者均采取

13、不抗凝血標本，用ELISA檢測CMVIgG和IgM抗體。術(shù)后每周抽EDTA抗凝血一次共3個月，分別采用NASBA法檢測IE-mRNA、pp67-mRNA和免疫組化EnvisionTM二步法檢測pp65抗原血癥。均采用Pred+MMF+CsA\FK506三聯(lián)免疫抑制治療，發(fā)生急性排斥反應者給予MP沖擊治療3～5天，無效者改用ATG或OKT3。初次檢出任何一項陽性結(jié)果時靜脈給予丙氧鳥苷2.5～5mg·kg-1·d-1，直至轉(zhuǎn)陰后繼續(xù)治療7～

14、14天。發(fā)現(xiàn)CMV病時丙氧鳥苷劑量加倍，治療無效或出現(xiàn)毒副作用如白細胞、血小板低下時改用磷甲酸鈉。 結(jié)果：(1)術(shù)前血清學狀況及術(shù)后CMV病感染率：術(shù)前供者lgG抗體陽性者15例，接受陽性供體的受者7例為IgG陽性，8例為IgG陰性。接受供者IgG抗體陽性腎臟患者的感染率明顯高于陰性者。(2)CMV抗原指數(shù)檢測結(jié)果：55例患者術(shù)后出現(xiàn)抗原陽性29例(52.7％)，陽性細胞數(shù)為2.0～60.5/5萬PMNL，平均12.3/5萬PM

15、NL，其中＞10個/5萬PMNL者17例，＞20個/5萬PMNL者5例。觀察期內(nèi)(術(shù)后半年內(nèi))發(fā)生有癥狀的活動性CMV感染(CMV病)13例。發(fā)生CMV病者的平均抗原指數(shù)高于非CMV病患者。IE-mRNA陽性患者的平均抗原指數(shù)高于陰性者。(3)IE-mRNA、pp67-mRNA及抗原血癥診斷指標比較：55例患者中，pp65抗原血癥陽性29例(52.7％)，pp67-mRNA陽性14例(25.4％)，IE-mRNA陽性20例(36.4％)

16、。發(fā)生有CMV病13例，均接受了更昔洛韋治療，10例治療后檢測結(jié)果陰轉(zhuǎn)，同時癥狀消失。有2例出現(xiàn)ARDS，其中1例因呼吸衰竭死亡。IE-mRNA的敏感度、特異度、陽性預測值和陰性預測值分別為92.3％、80.9％、60.0％和97.1％。(4)三項檢測指標的動態(tài)變化：lE-mRNA首次檢出平均時間(31.O±15.4天)，早于pp67-mRNA(43.7±16.3)和pp65抗原血癥(39.6±15.6天)。而pp67-mRNA的平均陰

17、轉(zhuǎn)時間早于其他兩項。 結(jié)論：(1)腎移植術(shù)前病人的CMV血清學狀況無論是陽性還是陰性，如果接受CMV陽性供者的腎臟，則術(shù)后感染發(fā)生率明顯高于接受CMV陰性供者腎臟的病人。(2)CMV病患者的平均抗原指數(shù)水平高于非CMV病者，說明抗原指數(shù)與CMV感染的嚴重程度有一定的關(guān)系。但某些抗原指數(shù)高者可能并無臨床癥狀，而低抗原指數(shù)者也有可能出現(xiàn)明顯的發(fā)熱等臨床表現(xiàn)。IE-mRNA陽性者的平均抗原指數(shù)高于陰性者。(3)IE-mRNA具有相對合