細(xì)胞膜和線粒體縫隙連接蛋白43介導(dǎo)的氧化應(yīng)激平衡在后處理中的作用研究.pdf

1、線粒體活性氧(reactive oxygen species，ROS)爆發(fā)導(dǎo)致線粒體損傷進而引起心肌細(xì)胞凋亡是心肌缺血/再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)損傷的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。特別是再灌注早期，積極調(diào)控線粒體氧化應(yīng)激平衡是防治心肌I/R損傷的關(guān)鍵。缺血后處理(isehemic postconditioning，IPC)，即心肌缺血后在再灌注前對缺血心肌反復(fù)短暫缺血再灌注處理，是迄今已知最強的缺血心肌內(nèi)源性保護方法。由于

2、可在不可預(yù)見的心肌缺血后再灌注期間進行，IPC具有良好的臨床應(yīng)用前景。然而，IPC機制目前并不十分清楚。細(xì)胞膜和線粒體縫隙連接蛋白(connexin，Cx)43與心肌缺血再灌注損傷及氧化應(yīng)激密切相關(guān)。假設(shè)細(xì)胞膜和線粒體Cx43介導(dǎo)的氧化應(yīng)激平衡是缺氧后處理(hypoxia postconditioning，HPC)和IPC心臟保護效應(yīng)的重要因素。本研究分三部分內(nèi)容。
　　首先，我們建立離體心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧(Hypoxia/reo

3、xygenation，H/R)和大鼠在體I/R損傷模型，實施HPC和IPC，在離體細(xì)胞和在體動物水平觀察后處理對心肌細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果顯示HPC和IPC顯著減輕H/R及I/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡及心肌損傷。
　　接著，我們從細(xì)胞膜和線粒體水平探討后處理抗心肌細(xì)胞凋亡機制，發(fā)現(xiàn)HPC和IPC顯著抑制線粒體活性氧爆發(fā)，上調(diào)心肌細(xì)胞及組織線粒體和細(xì)胞膜Bcl-2蛋白，下調(diào)Bax蛋白。在此基礎(chǔ)上以氧自由基清除劑超氧化物歧化酶(Supero

4、xide dismutase，SOD)和過氧化氫酶(catalase，CAT)及熱休克蛋白90(heat shock protein90，Hsp90)抑制劑格爾德霉素(geldanamycin，GA)干預(yù)，以探討后處理過程中線粒體氧化應(yīng)激平衡對心肌細(xì)胞凋亡的影響。發(fā)現(xiàn)單獨應(yīng)用SOD或CAT不影響HPC和IPC抗凋亡作用，而二者聯(lián)合及單獨應(yīng)用GA則減弱HPC和IPC抗凋亡作用，揭示線粒體ROS在HPC和IPC的心臟保護中發(fā)揮重要作用。

5、r>　　最后，為了闡明HPC和IPC是如何調(diào)控ROS的生成來發(fā)揮心臟保護作用，我們采用RNA干擾技術(shù)將Cx43mRNA在轉(zhuǎn)錄水平沉默，構(gòu)建Cx43低表達(dá)SD大鼠離體心肌細(xì)胞H/R模型及活體I/R模型，觀察Cx43低表達(dá)對HPC和IPC線粒體ROS產(chǎn)生及心肌細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果顯示Cx43低表達(dá)明顯減少HPC和IPC線粒體ROS，增加心肌細(xì)胞凋亡，提示Cx43低表達(dá)取消或減弱了HPC和IPC的心肌保護作用，揭示線粒體和細(xì)胞膜Cx43調(diào)控的

6、氧化應(yīng)激平衡在缺氧及缺血后處理心臟保護中發(fā)揮重要作用。
　　第一部分后處理對缺氧復(fù)氧及缺血再灌注心肌保護作用研究
　　目的:建立有效的HPC和IPC心臟保護方法，在離體細(xì)胞和在體動物水平觀察后處理對心肌細(xì)胞凋亡的影響。
　　方法:本研究分離體細(xì)胞和在體動物實驗兩部分:1.建立離體心肌細(xì)胞H/R損傷模型，將細(xì)胞分為對照組、H/R組（缺氧3h后復(fù)氧6h）、HPC組(缺氧3h后行復(fù)氧/缺氧5 min，反復(fù)3次，再復(fù)氧6h)，

7、應(yīng)用Hoechst染色、流式細(xì)胞儀檢測心肌細(xì)胞凋亡。2.建立大鼠在體I/R損傷模型，24只大鼠隨機分為假手術(shù)組（冠狀動脈只穿線，不結(jié)扎）、I/R組（冠狀動脈前降支缺血30 min后再灌注2h）、IPC組（冠狀動脈前降支缺血30 min后行再灌注/缺血30 s，反復(fù)3次，然后再灌注2h），通過心電圖、心肌酶學(xué)及病理組織切片評價后處理的效果，應(yīng)用TUNEL法檢測心肌細(xì)胞凋亡。
　　結(jié)果：與對照組比較，H/R組、HPC組細(xì)胞凋亡率明顯升

8、高(P＜0.01);與H/R組比較，HPC組細(xì)胞凋亡率明顯降低(P＜0.01);與假手術(shù)組比較，I/R組、IPC組心肌細(xì)胞凋亡數(shù)及心肌LDH、CK-MB明顯升高(P＜0.05);與I/R組比較，IPC組心肌細(xì)胞凋亡數(shù)及血清LDH、CK-MB明顯降低(P＜0.05)。
　　結(jié)論：離體心肌細(xì)胞和在體大鼠水平顯示:HPC和IPC顯著減輕H/R及I/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡及心肌損傷。
　　第二部分后處理中線粒體氧化應(yīng)激平衡對心肌細(xì)胞凋

9、亡的影響及其機制研究
　　目的：1.探討后處理抗H/R及I/R心肌細(xì)胞凋亡的機制。2.觀察氧自由基清除劑SOD、CAT和Hsp90抑制劑GA對后處理抗凋亡效應(yīng)的影響，探討后處理中線粒體氧化應(yīng)激平衡對細(xì)胞膜和線粒體Bcl-2和Bax蛋白調(diào)控心肌細(xì)胞凋亡的作用。
　　方法：本研究分四部分內(nèi)容:1.建立離體心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷模型，將細(xì)胞分為對照組、H/R組、HPC組，通過差速離心制備心肌細(xì)胞線粒體和細(xì)胞膜蛋白，應(yīng)用熒光探針測定

10、心肌細(xì)胞線粒體活性氧，Western blot檢測心肌細(xì)胞線粒體和細(xì)胞膜Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)。2.建立大鼠在體缺血/再灌注損傷模型，24只大鼠隨機分為假手術(shù)組、I/R組、IPC組，制備心肌組織線粒體和細(xì)胞膜蛋白，應(yīng)用熒光探針測定心肌組織線粒體活性氧，Western blot檢測心肌組織線粒體和細(xì)胞膜Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)。3.心肌細(xì)胞缺氧3h后，分別進行:(1)復(fù)氧5 min、缺氧5 min，反復(fù)3次，再復(fù)氧6h（HPC組），

11、(2)應(yīng)用SOD100 U/mL后立即進行(1)的操作(SOD+HPC組)，(3)應(yīng)用CAT120 U/mL后立即進行(1)的操作（CAT+HPC組），(4)應(yīng)用SOD聯(lián)合CAT后立即進行(1)的操作（SOD+CAT+HPC組），(5)應(yīng)用GA lumol/L后立即進行(1)的操作（GA+HPC組），應(yīng)用熒光探針測定心肌細(xì)胞線粒體活性氧，應(yīng)用Hoechst染色、流式細(xì)胞儀檢測心肌細(xì)胞凋亡，Western blot檢測心肌細(xì)胞線粒體和細(xì)胞

12、膜Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)。4.40只SD大鼠隨機分為5組，行冠狀動脈前降支缺血30 min后分別進行:(1)3個循環(huán)再灌注30 s、缺血30 s后處理，然后再灌注2h（IPC組）;(2)再灌注前15 min腹腔注射SOD30000U/kg，進行(1)的操作(SOD+IPC組);(3)再灌注前15 min腹腔注射CAT30000U/kg，進行(1)的操作（CAT+IPC組）;(4)再灌注前15 min腹腔注射SOD聯(lián)合CAT后，進行(

13、1)的操作（SOD+CAT+IPC組）;(5)再灌注前15 min腹腔注射GA0.6mg/kg，進行(1)的操作（GA+IPC組），應(yīng)用熒光探針測定心肌組織線粒體活性氧，末端原位標(biāo)記法檢測心肌細(xì)胞凋亡，Western blot檢測心肌組織線粒體和細(xì)胞膜Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果：1.心肌細(xì)胞線粒體活性氧H/R組(61.53±4.73)顯著升高，分別是對照組(13.25±1.07)和HPC組(32.72±2.86)的4～

14、5倍和2倍(P均＜0.01),SOD+HPC組(23.05±1.13)、CAT+HPC組(23.82±1.88)、SOD+CAT+HPC組(16.58±0.74)和GA+HPC組(17.52±1.02)較HPC組明顯降低(P均＜0.01),SOD+HPC組與CAT+HPC組比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。心肌細(xì)胞凋亡率SOD+CAT+HPC組[(44.60±3.12)％]和GA+HPC組[(45.65±3.71)％]顯著高于HPC組[

15、(26.42±2.96)％]、SOD+HPC組[(26.01±4.24)％]和CAT+HPC組[(26.98±3.66)％],P均＜0.01，HPC組、SOD+HPC組和CAT+HPC組比較無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。心肌細(xì)胞線粒體和細(xì)胞膜Bcl-2蛋白在HPC組、SOD+HPC組和CAT+HPC組顯著上調(diào)(P均＜0.01)，Bax蛋白則顯著下調(diào)(P均＜0.01);H/R組、SOD+CAT+HPC組和GA+HPC組Bcl-2蛋白顯著下

16、調(diào)(P＜0.01)，Bax蛋白顯著上調(diào)(P均＜0.01)。2.心肌組織線粒體活性氧I/R組(72.26±4.01)較假手術(shù)組(15.45±2.21)和IPC組(35.59±3.49)顯著升高（P均＜0.01）;SOD+IPC組(23.26±2.03),CAT+IPC組(25.03±2.59),GA+IPC組(17.77±1.42)和SOD+CAT+IPC組(16.21±1.62)較IPC組顯著降低(P均＜0.01)，SOD+IPC組與C

17、AT+IPC組比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。心肌細(xì)胞凋亡數(shù)SOD+CAT+IPC組[20.6±2.5）個/視野]和GA+IPC組[(23.4±2.3)個/視野]顯著高于IPC組[(12.3±2.4)個/視野]、SOD+IPC組[(13.3±2，3)個/視野]和CAT+IPC組[(13.0±1.6)個/視野]，P均40.05，IPC組、SOD+IPC組和CAT+IPC組比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。心肌組織線粒體和細(xì)胞膜Bcl-2

18、蛋白在IPC組、SOD+IPC組和CAT+IPC組顯著上調(diào)（P均＜0.01），Bax蛋白則顯著下調(diào)(P均＜0.01); I/R組、SOD+CAT+IPC組和GA+IPC組Bcl-2蛋白顯著下調(diào)(P＜0.01)，Bax蛋白顯著上調(diào)（P均＜0.O1）。
　　結(jié)論：后處理抑制線粒體活性氧爆發(fā)，減輕缺氧/復(fù)氧及缺血/再灌注心肌細(xì)胞凋亡，其抗凋亡機制可能與線粒體和細(xì)胞膜Bcl-2蛋白表達(dá)上調(diào)和Bax蛋白表達(dá)下調(diào)有關(guān);單獨應(yīng)用SOD或CAT不

19、影響后處理抗凋亡作用，而二者聯(lián)合及應(yīng)用格爾德霉素則減弱后處理抗凋亡作用;線粒體活性氧在后處理的心臟保護作用發(fā)揮重要作用。
　　第三部分線粒體和細(xì)胞膜縫隙連接蛋白43調(diào)控的氧化應(yīng)激平衡在后處理中的作用研究
　　目的：探討線粒體和細(xì)胞膜Cx43調(diào)控的氧化應(yīng)激平衡對缺氧和缺血后處理心臟保護作用的影響。
　　方法：本研究分四部分內(nèi)容:1.Cx43正常表達(dá)在缺氧后處理心肌保護中的作用。建立離體心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷模型，心肌細(xì)胞

20、缺氧3h后，分別進行:(1)復(fù)氧6h（H/R組），(2)復(fù)氧5 min、缺氧5 min，反復(fù)3次，再復(fù)氧6h（HPC組），(3)應(yīng)用SOD100 U/mL后立即進行(2)的操作（SOD+HPC組），(4)應(yīng)用CAT120 U/mL后立即進行(2)的操作（CAT+HPC組），(5)應(yīng)用SOD聯(lián)合CAT后立即進行(2)的操作（SOD+CAT+HPC組），(6)應(yīng)用GA5umol/mL后立即進行(2)的操作(GA+HPC組)。對照組心肌細(xì)胞在

21、復(fù)氧條件下培養(yǎng)9h。通過熒光定量PCR法測定細(xì)胞Cx43mRNA表達(dá)，并差速離心制備心肌細(xì)胞線粒體和細(xì)胞膜蛋白，應(yīng)用Western blot檢測心肌細(xì)胞線粒體和細(xì)胞膜總Cx43(TCx43)和磷酸化Cx43(P Cx43)蛋白表達(dá)。2.Cx43正常表達(dá)在缺血后處理心肌保護中的作用。建立大鼠在體缺血/再灌注損傷模型，56只SD大鼠隨機分為7組，行冠狀動脈前降支缺血30 min后分別進行:(1)再灌注2h（I/R組）;(2)3個循環(huán)再灌注3

22、0 s、缺血30 s后處理，然后再灌注2h（IPC組）;(3)再灌注前15 min腹腔注射SOD30000U/kg，進行(2)的操作(SOD+IPC組);(4)再灌注前15 min腹腔注射CAT30000U/kg，進行(2)的操作（CAT+IPC組）;(5)再灌注前15 min腹腔注射SOD聯(lián)合CAT后，進行(2)的操作（SOD+CAT+IPC組）;(6)再灌注前15 min腹腔注射GA0.6mg/kg，進行(2)的操作（GA+IPC組

23、）。假手術(shù)組冠狀動脈只穿線，不結(jié)扎。通過熒光定量PCR法測定組織Cx43mRNA表達(dá)，應(yīng)用Western blot檢測心肌組織線粒體和細(xì)胞膜總Cx43和磷酸化Cx43蛋白表達(dá)。3.RNA干擾心肌細(xì)胞Cx43表達(dá)對缺氧后處理心肌保護作用的影響。建立Cx43低表達(dá)離體心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷模型，通過熒光定量PCR和Western blot驗證Cx43基因沉默效果。將細(xì)胞分為對照組、陰性對照組（轉(zhuǎn)染pGCFu-RNAi-NC-LV，NC組）、

24、Cx43正常表達(dá)HPC組（Cx43-HPC組），Cx43低表達(dá)HPC組（轉(zhuǎn)染 Cx43-RNAi-LV后進行HPC，iCx43-HPC組），通過差速離心制備心肌細(xì)胞線粒體和細(xì)胞膜蛋白，應(yīng)用熒光探針測定心肌細(xì)胞線粒體活性氧，應(yīng)用Hoechst染色、流式細(xì)胞儀檢測心肌細(xì)胞凋亡，Western blot檢測心肌細(xì)胞線粒體和細(xì)胞膜Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)。4.RNA干擾心肌組織Cx43表達(dá)對缺血后處理心肌保護作用的影響。建立Cx43低表達(dá)大鼠

25、在體缺血/再灌注損傷模型，并通過熒光定量PCR和Western blot驗證Cx43基因沉默效果。32只SD大鼠隨機分為4組，(1)假手術(shù)組（Sham，冠狀動脈只穿線，不結(jié)扎）;(2) Cx43正常表達(dá)IPC組（Cx43-IPC組，冠狀動脈前降支缺血30 min后進行3個循環(huán)缺血30 s，再灌注30 s后處理，然后再灌注2 h）;(3)Cx43低表達(dá)IPC組（iCx43-IPC組，大鼠心肌轉(zhuǎn)染Cx43-RNAi-LV后，行冠狀動脈前降支

26、缺血30 min，然后再灌注30 s，缺血30 s，反復(fù)3次，再灌注2h）;(4)陰性對照組（NC組，大鼠心肌轉(zhuǎn)染pGCFu-RNAi-NC-LV后，冠狀動脈只穿線，不結(jié)扎）。應(yīng)用熒光探針測定心肌組織線粒體活性氧，末端原位標(biāo)記法檢測心肌細(xì)胞凋亡，Western blot檢測心肌組織線粒體和細(xì)胞膜Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果：1.與對照組比較，HPC組、SOD+HPC組和CAT+HPC組心肌細(xì)胞Cx43的mRNA、線粒體和

27、細(xì)胞膜TCx43與PCx43蛋白表達(dá)量顯著上調(diào)(P均＜0.01)，H/R組、SOD+CAT+HPC組和GA+HPC組Cx43的mRNA、心肌細(xì)胞線粒體和細(xì)胞膜TCx43與PCx43蛋白表達(dá)量顯著下調(diào)（P均＜0.01）。2.與假手術(shù)組比較，IPC組、SOD+IPC組和CAT+IPC組心肌組織Cx43的mRNA、線粒體和細(xì)胞膜TCx43與PCx43蛋白表達(dá)量顯著上調(diào)（P均＜0.01），I/R組、SOD+CAT+IPC組和GA+IPC組Cx4

28、3的mRNA、線粒體和細(xì)胞膜TCx43與PCx43蛋白表達(dá)顯著下調(diào)（P均＜0.01）。3.心肌細(xì)胞凋亡率iCx43-HPC組(31.46±3.35)％顯著高于對照組(4.68±1.45)％，陰性對照組(5.51±1.53)％和Cx43-HPC組(20.11±2.84)％;心肌細(xì)胞線粒體活性氧iCx43-HPC組(16.78±2.05)較對照組(10.95±1.82)和陰性對照組(11.76±2.3)有所升高，但顯著低于Cx43-HPC組

29、(30.67±2.08)（P均＜0.01）;心肌細(xì)胞線粒體和細(xì)胞膜Bcl-2蛋白在Cx43-HPC組顯著上調(diào)（P＜0.01），Bax蛋白則顯著下調(diào)(P＜0.01);iCx43-HPC組Bcl-2蛋白顯著下調(diào)(P＜0.01)，Bax蛋白顯著上調(diào)(P＜0.01)。4.心肌細(xì)胞凋亡數(shù)iCx43-IPC組(23.5±2.8)個/視野，顯著高于假手術(shù)組(1.5±0.6)個/視野，陰性對照組(1.7±0.5)個/視野和Cx43-IPC組(12.3±

30、2.4)個/視野;心肌組織線粒體活性氧iCx43-IPC組(15.74±1.00)較假手術(shù)組(10.65±0.96)，陰性對照組(10.82±0.78)有所升高，但顯著低于Cx43-IPC組(31.99±1.02)(P均＜0.01);心肌組織線粒體和細(xì)胞膜Bcl-2蛋白在Cx43-IPC組顯著上調(diào)(P均＜0.01)，Bax蛋白則顯著下調(diào)(P均＜0.01); iCx43-IPC組Bcl-2蛋白顯著下調(diào)(P＜0.01)，Bax蛋白顯著上調(diào)（