人類羊膜細(xì)胞的生物學(xué)特性及其在神經(jīng)修復(fù)和移植免疫調(diào)控中的作用.pdf

1、自二十世紀(jì)八十年代起，特別是1998年人胚胎干細(xì)胞建立以后，人們?cè)絹?lái)越重視干細(xì)胞在治療一些難治性疾病方面的應(yīng)用，如中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)疾病、心血管疾病和糖尿病。在干細(xì)胞移植治療方面，人們已嘗試過(guò)胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞(如造血干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞等)治療相關(guān)疾病，并取得了一定的療效，但胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞在臨床上應(yīng)用還面臨很多問(wèn)題，如安全性、免疫排斥反應(yīng)、細(xì)胞來(lái)源有限以及倫理道德等，嚴(yán)重阻礙了干細(xì)胞在臨床上的應(yīng)用。

2、r>　　 近年來(lái)，人們發(fā)現(xiàn)在哺乳動(dòng)物羊膜內(nèi)也存在干細(xì)胞，這種干細(xì)胞具有多分化潛力，并且有人報(bào)道羊膜干細(xì)胞的增殖能力要高于骨髓來(lái)源的干細(xì)胞。羊膜干細(xì)胞(amniotic stem cells)的發(fā)現(xiàn)和研究為上述干細(xì)胞臨床應(yīng)用存在的問(wèn)題提供了一種可行的解決途徑。羊膜干細(xì)胞來(lái)源于羊膜(Amnion)，也可稱作胎膜，是與發(fā)育中的胎兒聯(lián)系緊密的胚胎發(fā)育早期產(chǎn)物，是母體與胎兒間進(jìn)行物質(zhì)交換的重要組織。羊膜干細(xì)胞主要分布在羊膜的上皮層和基底層，可表

3、達(dá)早期干細(xì)胞的一些不同標(biāo)記，如OCT-4，堿性磷酸酶(AKP)，神經(jīng)細(xì)胞特異的膠質(zhì)纖維相關(guān)蛋白(GFAP)，神經(jīng)元特異性標(biāo)記(MAP2)以及神經(jīng)干細(xì)胞特異性標(biāo)記(Nestin)，肝薄壁組織細(xì)胞蛋白等，說(shuō)明既然羊膜形成于胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)發(fā)育早期，就有可能保留未成熟低分化的干細(xì)胞，仍保留多分化潛能。
　　 同時(shí)人羊膜干細(xì)胞還具有以下一些特點(diǎn)：
　　 1．自身缺乏主要組織相容性復(fù)合體Ⅰ、Ⅱ類抗原，如HLA-A，B，C和DR以及B2

4、免疫球蛋白，移植后不會(huì)產(chǎn)生免疫原性，同時(shí)人羊膜細(xì)胞又表達(dá)HLA-E、G抗原，使其具有免疫抑制活性。
　　 2．人羊膜細(xì)胞來(lái)源非常廣泛，不會(huì)產(chǎn)生倫理或者道德的問(wèn)題。
　　 3．不具致瘤性。
　　 人們已做了大量的研究工作證明了人羊膜干細(xì)胞治療疾病的潛力：Zhao等人發(fā)現(xiàn)人羊膜干細(xì)胞移植入心臟后，分化成心肌樣細(xì)胞；Sakuragawa等人報(bào)道了羊膜上皮細(xì)胞能有效抑制PD大鼠多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞的退變，并且使大鼠的疾病行為

5、明顯改善；Hideori-Okawa等將大鼠羊膜上皮細(xì)胞作為供體細(xì)胞移植到腦缺血模型鼠的海馬中，發(fā)現(xiàn)人羊膜上皮細(xì)胞以類似于CA錐體層神經(jīng)元的方式存活，這一重要結(jié)果提示羊膜細(xì)胞有轉(zhuǎn)變?yōu)樯窠?jīng)樣細(xì)胞的可能，并且具有治療缺血性腦損傷的潛能；Sankar等發(fā)現(xiàn)羊膜上皮細(xì)胞能部分恢復(fù)脊髓損傷；Wei等報(bào)道羊膜上皮細(xì)胞能使糖尿病鼠的血糖水平恢復(fù)正常，羊膜上皮細(xì)胞在體內(nèi)有潛力分化成β胰島細(xì)胞，提示羊膜上皮細(xì)胞有治療糖尿病的潛力等等。
　　 人們

6、還有利用人羊膜細(xì)胞作為基因治療的工程性細(xì)胞載體，來(lái)治療一些遺傳性疾病，如黏多糖貯積病Ⅶ、家族性高固醇血癥遺傳性肝臟疾病等，也取得不錯(cuò)的效果。
　　 在我國(guó)，上海中科院細(xì)胞研究所已建立和完善了羊膜干細(xì)胞的培養(yǎng)平臺(tái)和羊膜細(xì)胞基因改造平臺(tái)，并在上述基礎(chǔ)之上，開展了羊膜干細(xì)胞治療疾病的多項(xiàng)動(dòng)物研究，包括以帕金森病為代表的神經(jīng)退行性疾病的治療，以腦缺血為主的腦損傷治療，以脊髓損傷為主的神經(jīng)再生治療，以耳毛細(xì)胞再生為主的神經(jīng)性耳聾治療以及糖

7、尿病治療等，并取得了初步的成果。目前已完成了羊膜干細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因羊膜干細(xì)胞治療腦缺血性疾病的臨床前試驗(yàn)工作，結(jié)果表明羊膜干細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因羊膜干細(xì)胞對(duì)腦缺血性疾病具有很好的治療作用。
　　 以上眾多的有關(guān)人類羊膜細(xì)胞的基礎(chǔ)及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究均表明該細(xì)胞有廣闊的臨床應(yīng)用前景，羊膜及其所包含的細(xì)胞如果再結(jié)合組織工程技術(shù)，將能開發(fā)出各種生物產(chǎn)品以滿足臨床各種疾病治療的需求。
　　 本研究著重從羊膜細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化、神經(jīng)修復(fù)以及中樞

8、神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)移植免疫等方面進(jìn)行探討，為臨床上應(yīng)用羊膜細(xì)胞修復(fù)神經(jīng)創(chuàng)傷作前期準(zhǔn)備。
　　 第一部分人羊膜上皮細(xì)胞與人羊膜間充質(zhì)細(xì)胞體外分離培養(yǎng)及生物學(xué)特性的比較
　　 目的：
　　 比較人羊膜上皮細(xì)胞(AECs)與人羊膜間充質(zhì)細(xì)胞(AMSCs)體外分離培養(yǎng)方法及兩種細(xì)胞的生物學(xué)特性。
　　 方法：
　　 采取酶消化法分離人羊膜細(xì)胞，利用兩種細(xì)胞居于羊膜組織的不同層次及與羊膜基質(zhì)不同的附著力各自進(jìn)行分離

9、培養(yǎng)，通過(guò)相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志的表達(dá)并作比較性分析，同時(shí)進(jìn)行克隆化培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)，
　　 自二十世紀(jì)八十年代起，特別是1998年人胚胎干細(xì)胞建立以后，人們?cè)絹?lái)越重視干細(xì)胞在治療一些難治性疾病方面的應(yīng)用，如中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)疾病、心血管疾病和糖尿病。在干細(xì)胞移植治療方面，人們已嘗試過(guò)胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞（如造血干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞等）治療相關(guān)疾病，并取得了一定的療效，但胚胎

10、干細(xì)胞和成體干細(xì)胞在臨床上應(yīng)用還面臨很多問(wèn)題，如安全性、免疫排斥反應(yīng)、細(xì)胞來(lái)源有限以及倫理道德等，嚴(yán)重阻礙了干細(xì)胞在臨床上的應(yīng)用。
　　 近年來(lái)，人們發(fā)現(xiàn)在哺乳動(dòng)物羊膜內(nèi)也存在干細(xì)胞，這種干細(xì)胞具有多分化潛力，并且有人報(bào)道羊膜干細(xì)胞的增殖能力要高于骨髓來(lái)源的干細(xì)胞。羊膜干細(xì)胞(amniotic stem cells)的發(fā)現(xiàn)和研究為上述干細(xì)胞臨床應(yīng)用存在的問(wèn)題提供了一種可行的解決途徑。羊膜干細(xì)胞來(lái)源于羊膜(Amnion)，也可稱作

11、胎膜，是與發(fā)育中的胎兒聯(lián)系緊密的胚胎發(fā)育早期產(chǎn)物，是母體與胎兒間進(jìn)行物質(zhì)交換的重要組織。羊膜干細(xì)胞主要分布在羊膜的上皮層和基底層，可表達(dá)早期干細(xì)胞的一些不同標(biāo)記，如OCT-4，堿性磷酸酶(AKP)，神經(jīng)細(xì)胞特異的膠質(zhì)纖維相關(guān)蛋白(GFAP)，神經(jīng)元特異性標(biāo)記(MAP2)以及神經(jīng)干細(xì)胞特異性標(biāo)記(Nestin)，肝薄壁組織細(xì)胞蛋白等，說(shuō)明既然羊膜形成于胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)發(fā)育早期，就有可能保留未成熟低分化的干細(xì)胞，仍保留多分化潛能。
　　

12、 同時(shí)人羊膜干細(xì)胞還具有以下一些特點(diǎn)：
　　 1．自身缺乏主要組織相容性復(fù)合體Ⅰ、Ⅱ類抗原，如HLA-A，B，C和DR以及β2免疫球蛋白，移植后不會(huì)產(chǎn)生免疫原性，同時(shí)人羊膜細(xì)胞又表達(dá)HLA-E、G抗原，使其具有免疫抑制活性。
　　 2．人羊膜細(xì)胞來(lái)源非常廣泛，不會(huì)產(chǎn)生倫理或者道德的問(wèn)題。
　　 3．不具致瘤性。
　　 人們已做了大量的研究工作證明了人羊膜干細(xì)胞治療疾病的潛力：Zhao等人發(fā)現(xiàn)人羊膜干細(xì)胞移

13、植入心臟后，分化成心肌樣細(xì)胞；Sakuragawa等人報(bào)道了羊膜上將由PHA激發(fā)的T細(xì)胞與AECs和AMSCs共培養(yǎng)，觀察T細(xì)胞與兩者的相互作用。
　　 結(jié)果：
　　 (1)兩種來(lái)源的羊膜細(xì)胞均貼壁生長(zhǎng)，呈現(xiàn)不同的形態(tài)外觀，兩種細(xì)胞均高表達(dá)CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD106、CD166，但不表達(dá)CD34、CD45、HLA-DR。
　　 (2)AMSCs體外能傳代及克隆化培養(yǎng)，AECs則

14、不能，兩種細(xì)胞在體外均能誘導(dǎo)向神經(jīng)元樣細(xì)胞方向分化。
　　 (3)兩種來(lái)源的羊膜細(xì)胞在體外對(duì)T細(xì)胞的活化增殖有明顯的抑制作用。
　　 結(jié)論：
　　 人類AECs和AMSCs具有類似的體外生物學(xué)特性、表型、多向分化的潛能及其負(fù)性免疫調(diào)節(jié)作用，是一類理想的組織工程種子細(xì)胞。
　　 第二部分羊膜細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化及與絲素蛋白支架構(gòu)建復(fù)合體移植對(duì)大鼠復(fù)合損傷脊髓的修復(fù)作用
　　 目的：
　　 探討體

15、外羊膜細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化的方法，羊膜細(xì)胞在生物支架上的生長(zhǎng)特點(diǎn)，研究種子細(xì)胞移植結(jié)合組織工程化技術(shù)在神經(jīng)修復(fù)中的運(yùn)用前景。
　　 方法：
　　 采用酶消化法分離人羊膜組織，分別進(jìn)行貼壁培養(yǎng)和傳代，通過(guò)倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達(dá)作比較性分析，鑒定AECs及AMSCs，并在誘導(dǎo)劑作用下進(jìn)行細(xì)胞分化實(shí)驗(yàn)，重點(diǎn)向少枝膠質(zhì)細(xì)胞方向進(jìn)行分化干預(yù)；構(gòu)建羊膜細(xì)胞與絲素蛋白支架復(fù)合體，找到生物支架有利于羊膜

16、細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖的證據(jù)；分組進(jìn)行羊膜細(xì)胞移植動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究，從動(dòng)物行為學(xué)、病理切片、免疫細(xì)胞化學(xué)法、電鏡檢查等多角度了解組織工程化細(xì)胞移植在神經(jīng)修復(fù)方面的積極作用。
　　 結(jié)果：
　　 同是來(lái)源于羊膜的兩種細(xì)胞都呈貼壁生長(zhǎng)，但形態(tài)卻迥異，AECs呈鵝卵石樣外觀，邊界清楚，折光性較強(qiáng)，而AMSCs則呈成纖維細(xì)胞樣形態(tài)，表面標(biāo)記物表達(dá)的差異在于前者表達(dá)上皮細(xì)胞標(biāo)記物CK19而不表達(dá)CD49d，后者表達(dá)CD49d而不表達(dá)CK19。人

17、AECs高表達(dá)CD29和CD44說(shuō)明其具有間充質(zhì)干細(xì)胞的表型特征。羊膜細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)分化后形成少突膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞，多數(shù)表達(dá)Galc，部分表達(dá)MBP。運(yùn)用掃描電鏡觀察體外絲素蛋白支架復(fù)合體細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，發(fā)現(xiàn)支架的三維多孔結(jié)構(gòu)提高了細(xì)胞的粘附和增殖能力，細(xì)胞呈立體化生長(zhǎng)，相互間的突起聯(lián)接更多。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)行為學(xué)結(jié)果表明細(xì)胞移植組尤其是結(jié)合支架的復(fù)合移植組動(dòng)物行為功能恢復(fù)遠(yuǎn)較對(duì)照組良好，差異有顯著性。組織病理切片及組化實(shí)驗(yàn)表明移植物同宿主間整合良好

18、，移植細(xì)胞有存活并向神經(jīng)細(xì)胞轉(zhuǎn)化證據(jù)。神經(jīng)示蹤技術(shù)同樣表明了復(fù)合支架移植組有更佳的神經(jīng)軸索修復(fù)表現(xiàn)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果還證實(shí)了絲素蛋白支架有著良好的組織相容性，植入支架復(fù)合物的損傷脊髓膠質(zhì)疤痕形成明顯減少，獲得了更好的神經(jīng)修復(fù)。
　　 結(jié)論：
　　 羊膜源性干細(xì)胞具有多向分化潛能，體外及在體狀態(tài)都有向神經(jīng)細(xì)胞分化的能力，在生物支架材料上羊膜細(xì)胞呈現(xiàn)良好的立體化擴(kuò)增特點(diǎn)，運(yùn)用羊膜細(xì)胞同絲素蛋白支架構(gòu)建的復(fù)合體移植手術(shù)對(duì)大鼠的脊髓

19、損傷有著更為理想的修復(fù)作用。本實(shí)驗(yàn)同時(shí)證實(shí)在適當(dāng)轉(zhuǎn)化條件下羊膜細(xì)胞可向少突膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，轉(zhuǎn)化后的終末端神經(jīng)細(xì)胞并未展示出在神經(jīng)修復(fù)方面有更多優(yōu)勢(shì)，而結(jié)合支架應(yīng)用的組織工程化復(fù)合移植策略明顯有利于軸索再生及髓鞘形成。
　　 第三部分人羊膜細(xì)胞負(fù)性協(xié)同刺激分子PD-L1表達(dá)的檢測(cè)及對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)小膠質(zhì)細(xì)胞活化的調(diào)控作用
　　 目的：
　　 探討人羊膜細(xì)胞負(fù)性協(xié)同刺激分子PD-L1的表達(dá)及對(duì)體外小膠質(zhì)

20、細(xì)胞MI的負(fù)性協(xié)同作用。
　　 方法：
　　 用原代培養(yǎng)10天左右的AECs及體外擴(kuò)增3代的AMSCs，采用流式細(xì)胞儀和免疫熒光方法來(lái)分析兩種細(xì)胞協(xié)同刺激分子的表達(dá)情況,3H-TdR摻入法檢測(cè)羊膜細(xì)胞對(duì)脂多糖刺激后的MI增殖的影響，以及PD-L1單克隆抗體部分阻斷羊膜細(xì)胞抑制MI增殖的影響；流式細(xì)胞術(shù)分析羊膜細(xì)胞對(duì)脂多糖作用下MI細(xì)胞周期的影響，ELISA法檢測(cè)細(xì)胞因子水平，以及阻斷PD-L1作用后的變化。
　　

21、 結(jié)果：
　　 (1)人AECs及AMSCs均不表達(dá)CD80、CD83、CD86等正性協(xié)同刺激分子，但都較高表達(dá)負(fù)性分子PD-L1。
　　 (2)AECs及AMSCs均可抑制MI體外增殖，并使脂多糖刺激下的MI滯留于細(xì)胞周期的G0/G1期，以及調(diào)節(jié)TNF-α、NO等的分泌，由此表明，羊膜細(xì)胞介導(dǎo)的負(fù)性免疫調(diào)節(jié)作用部分是通過(guò)高表達(dá)PD-L1分子，PD-L1是羊膜細(xì)胞表達(dá)的主要負(fù)性免疫調(diào)節(jié)分子。
　　 結(jié)論：