基于靶點Cathepsin B的食管鱗癌近紅外光學(xué)活體成像研究.pdf

1、背景
　　在中國，食管癌的發(fā)病率和死亡率均列第4位。食管癌具有流行病學(xué)特征顯著不同的2種組織學(xué)類型:鱗癌和腺癌。在中國和其它東亞國家，90％以上的食管癌是鱗狀細(xì)胞癌，而在美國和歐洲國家，腺癌更常見。食管鱗癌(esophagealsquamouscellcarcinoma，ESCC)的預(yù)后很差，主要是因為大多數(shù)患者在晚期才被發(fā)現(xiàn)。因此，早期診斷、早期治療是改善食管鱗癌預(yù)后的關(guān)鍵。早期診斷主要依靠健康普查。普查的方法主要包括內(nèi)鏡檢查和

2、食管拉網(wǎng)細(xì)胞學(xué)檢查，但其靈敏度、特異性都不理想，甚至還會造成食管損傷。因此，臨床上急需高敏感性、高特異性且無創(chuàng)的診斷方法來提高ESCC的診斷能力。
　　腫瘤分子影像學(xué)(tumormolecularimaging)的成像基礎(chǔ)是腫瘤早期在代謝、細(xì)胞分子水平的改變，而非傳統(tǒng)影像學(xué)比如CT、MRI所顯示的疾病發(fā)展過程中較晚的形態(tài)學(xué)變化。對靶分子的特異性成像可以早期、特異地檢測腫瘤，具有傳統(tǒng)影像手段和方法不具有的優(yōu)點。這為ESCC的早期診斷

3、帶來了新的希望。組織蛋白酶B(cathepsinB，CB)在一些腫瘤中高表達(dá)，它和腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，符合分子影像學(xué)“靶”選擇的一般標(biāo)準(zhǔn)。另外，已有學(xué)者選擇CB作為成像靶點用于腫瘤診斷的實驗研究，并取得令人振奮的結(jié)果。因此，在本研究中我們將評估和探討CB作為一個新的成像靶點用于ESCC活體診斷的可行性，為后續(xù)臨床研究提供實驗數(shù)據(jù)和理論指導(dǎo)。
　　目的
　　1.通過檢測不同食管組織和ESCC細(xì)胞中CB的表達(dá)，初步判斷CB能

4、否作為ESCC及其癌前病變診斷成像的備選靶點。
　　2.應(yīng)用光學(xué)成像技術(shù)聯(lián)合新型CB可激活近紅外熒光探針進(jìn)行荷瘤鼠活體成像，觀察CB探針對移植瘤的定位和顯像，分析和探討CB作為一個新的成像靶點用于ESCC活體診斷的可行性。
　　方法
　　1.免疫組織化學(xué)法(immunohistochemistry,IHC)檢測80例食管組織樣本中CB的表達(dá)情況，其中包括正常食管、食管上皮內(nèi)瘤變病變，食管原位癌和浸潤癌各20例。

5、　　2.培養(yǎng)人正常食管上皮HET-1A細(xì)胞和人食管鱗癌Eca-109細(xì)胞，Westernblot檢測CB在其中的表達(dá)水平。
　　3.回收Eca-109腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)液，加入不同濃度的CB可激活近紅外熒光探針(12.5nM，25nM，50nM，100nM和200nM)，新鮮無血清培養(yǎng)液加入等量的CB探針為對照組。觀察、分析實驗組和對照組不同濃度的CB探針產(chǎn)生的熒光信號的差異，從而判斷Eca-109細(xì)胞是否分泌CB到胞外。
　　4

6、.CB可激活近紅外熒光探針預(yù)處理Eca-109腫瘤細(xì)胞，免疫細(xì)胞化學(xué)法(immunocytochemistry，ICC)觀察CB的表達(dá)和CB探針產(chǎn)生的近紅外熒光信號，確認(rèn)CB探針能夠順利進(jìn)入Eca-109細(xì)胞并且檢測發(fā)現(xiàn)CB的活性。
　　5.通過皮下種植Eca-109細(xì)胞建立人-小鼠ESCC移植瘤模型。當(dāng)腫瘤直徑達(dá)到6mm左右時，尾靜脈注射CB可激活近紅外熒光探針，應(yīng)用小動物活體成像系統(tǒng)進(jìn)行荷瘤鼠活體成像。每2h成像1次，連續(xù)成像

7、36h。觀察、拍照和分析腫瘤部位的熒光信號(n=6)。成像參數(shù):濾光片Cy5.5，激發(fā)波長675nm，發(fā)射波長680到720nm，曝光時間0.2s，光圈級數(shù)2，介質(zhì)中，視場12.5cm2。熒光強度定義為總輻射效率([p/s]/[μW/cm2])，用相同大小的感興趣區(qū)域(regionsofinterest，ROI)熒光定量。正常裸鼠作為對照組(n=3)。
　　6.活體成像后，避光取出移植瘤和裸鼠的主要內(nèi)臟器官，生理鹽水沖洗，一塊兒離

8、體成像。成像參數(shù)同上。觀察、拍照并分析各個器官包括移植瘤的近紅外熒光信號(n=6)。由于各個器官的大小和外形不一，熒光強度定義為平均輻射效率([p/s/cm2/sr]/[μW/cm2])，用不同大小的、不規(guī)則形的ROIs定量。這些ROIs和各個器官的外形一致。正常小鼠(n=3)的內(nèi)臟器官為對照組。
　　7.制作冰凍切片，近紅外熒光組織學(xué)檢查活體和離體成像中移植瘤熒光信號的來源。
　　8.IHC檢測BALB/c裸鼠主要內(nèi)臟器官

9、包括移植瘤中CB的表達(dá)情況。
　　結(jié)果
　　1.IHC結(jié)果顯示，人正常食管組織未見CB明顯表達(dá)，而CB在食管上皮內(nèi)瘤變病變、原位癌和浸潤癌中過表達(dá)，且表達(dá)量隨病變的進(jìn)展而升高;其陽性率分別為95％(19/20)、95％(19/20)和100％(20/20)。CB主要表達(dá)在ESCC細(xì)胞漿內(nèi)，極少量表達(dá)在腫瘤間質(zhì)的巨噬細(xì)胞和炎細(xì)胞。
　　2.Westernblot結(jié)果表明，人正常食管上皮HET-1A細(xì)胞不表達(dá)CB，而人食管

10、鱗癌Eca-109細(xì)胞高表達(dá)CB。這和IHC的結(jié)果一致。
　　3.實驗組與對照組相比，不同濃度CB探針的細(xì)胞培養(yǎng)液其熒光強度無明顯差異，說明Eca-109細(xì)胞在體外不分泌CB到胞外。
　　4.細(xì)胞免疫熒光結(jié)果表明，CB高表達(dá)在Eca-109細(xì)胞的胞漿中;CB可激活探針產(chǎn)生的近紅外熒光信號也局限在胞漿內(nèi)，且二者的部位完全一致。這說明CB探針分子有一定的通透性，能夠順利進(jìn)入Eca-109細(xì)胞，在CB的降解作用下產(chǎn)生熒光信號。

11、r>　　5.荷瘤鼠活體成像結(jié)果(n=6):注射CB探針后立即成像，起初小鼠整個身體只發(fā)出微弱的內(nèi)源性自發(fā)熒光(1.34×105±3.3×104)，腫瘤局部和身體其他部位的熒光強度無明顯差別;2h后，和正常小鼠相比，荷瘤鼠腫瘤部位出現(xiàn)特異的、高亮的近紅外熒光信號(9.78×109±2.1×108)，并隨時間的延長而增強，約32小時到達(dá)頂峰(2.90×1010±2.5×109)，之后平穩(wěn)下降。這表明CB探針在體內(nèi)保持相對穩(wěn)定，有適當(dāng)?shù)陌胨テ?/p>

12、，能順利進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，和CB充分反應(yīng)，在CB的降解作用下產(chǎn)生近紅外熒光信號。另外，成像過程中位置表淺的甲狀腺和睪丸也表現(xiàn)出相對高的熒光信號，但在各個成像時間點均明顯低于腫瘤部位的熒光強度(P＜0.05)，而且熒光強度變化幅度也較小。對照鼠的左肩胛區(qū)域在整個成像過程中沒有出現(xiàn)明顯的近紅外熒光信號(2.04×106±5.3×105)，但是它們的甲狀腺和睪丸卻出現(xiàn)和荷瘤鼠相同部位接近的熒光強度。
　　6.移植瘤和裸鼠主要內(nèi)臟器官離體成像

13、結(jié)果(n=6):和活體成像結(jié)果相似，離體成像中移植瘤的熒光信號也最強(5.81×108±4.3×107)(P＜0.05)。在內(nèi)臟器官中，肝、甲狀腺、腎和睪丸依次表現(xiàn)出相對高的熒光信號(3.14×108±3.5×107，2.26×108±4.4×107，2.71×108±3.8×107和1.66×108±2.2×107)，食管的熒光信號最弱(1.99×107±2.5×106)，而且毗鄰它的心臟和肺其信號也很低。移植瘤和各器官的熒光強度比如

14、下:腫瘤/肝1.85，腫瘤/腎2.57，腫瘤/心臟8.4，腫瘤/肺9.57，腫瘤/食管29.20，腫瘤/甲狀腺2.14，腫瘤/睪丸5.14，腫瘤/脾15.17，腫瘤/小腸9.217，這清楚地表明CB探針的腫瘤特異性（比值達(dá)到2.5一般即可認(rèn)為探針具有腫瘤特異性）。正常小鼠的內(nèi)臟器官（對照組）無明顯近紅外熒光信號。
　　7.近紅外熒光組織學(xué)顯示，腫瘤組織的近紅外熒光信號來源于腫瘤細(xì)胞的胞漿，這和CB表達(dá)的部位一致，說明活體和離體成像

15、中移植瘤的熒光信號來源于Eca-109細(xì)胞，而非其它器官或細(xì)胞。在移植瘤的邊緣腫瘤細(xì)胞減少，但近紅外熒光信號彌漫性增強，表明腫瘤組織侵襲前緣的CB活性升高。
　　8.BALB/c裸鼠CB陽性表達(dá)的器官有肝、腎、甲狀腺和睪丸，并且在組織學(xué)上CB的表達(dá)水平和器官的熒光強度相關(guān)，表明CB探針能夠反應(yīng)出體內(nèi)靶點的數(shù)量。這為活體和離體成像中CB探針發(fā)現(xiàn)肝、腎、甲狀腺和睪丸提供了合理的解釋。裸鼠心臟、肺、食管、脾和小腸未見CB明顯表達(dá)。

16、>　　結(jié)論
　　1.主要結(jié)論
　　(1)人正常食管組織缺乏CB表達(dá)，但在ESCC及其癌前病變中表達(dá)明顯上調(diào);ESCC細(xì)胞Eca-109高表達(dá)CB，而正常食管上皮HET-1A細(xì)胞不表達(dá)CB。因此，CB和ESCC的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，可能是ESCC及其癌前病變分子成像的一個備選靶點。
　　(2)應(yīng)用光學(xué)成像技術(shù)，聯(lián)合新型CB可激活近紅外熒光探針活體檢測人-小鼠ESCC皮下移植瘤是可行的。本研究的結(jié)果支持CB作為一個潛在的分子成像

17、靶點用于人食管鱗癌的診斷。
　　2.次要結(jié)論
　　(1)ESCC組織中CB主要表達(dá)在腫瘤細(xì)胞的漿內(nèi)，極少量表達(dá)在間質(zhì)的巨噬細(xì)胞和炎細(xì)胞。CB的活性在ESCC移植瘤的邊緣明顯增高。Eca-109細(xì)胞在體外不分泌CB到胞外。
　　(2)新型CB可激活近紅外熒光探針CatB680FASTTM有較強的CB特異性;在體內(nèi)相對穩(wěn)定、有適當(dāng)?shù)陌胨テ?有一定的通透性，在體內(nèi)外能夠順利進(jìn)入Eca-109腫瘤細(xì)胞，充分和CB反應(yīng)，在CB的