大鼠遠(yuǎn)端結(jié)腸平滑肌鈣庫(kù)操縱性通道及其功能的研究.pdf

1、在平滑肌收縮過(guò)程中，胞內(nèi)Ca2+濃度的變化是平滑肌細(xì)胞收縮的誘導(dǎo)因素，細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流是引起胞內(nèi)Ca2+濃度升高的主要來(lái)源。一般認(rèn)為，電壓操縱性Ca2+通道(voltage-operatedCa2+channel，VOCC)是介導(dǎo)平滑肌收縮過(guò)程中胞外Ca2+內(nèi)流的主要機(jī)制，但近期發(fā)現(xiàn)鈣庫(kù)操縱性(store-operated)和受體操縱性(receptor-operated)通道也參與平滑肌細(xì)胞的收縮反應(yīng)。 當(dāng)細(xì)胞外的信號(hào)激活受

2、體后，通過(guò)興奮性G蛋白激活磷脂酶C(phospholipaseC，PLC)，后者水解磷脂酰肌醇二磷酸(phosphatidylinositolbiphosphate，PIP2)，生成1，4，5-三磷酸肌醇(1,4,5-triphosphateinositol，IP3)和二酰甘油(diacylglycerol，DG)。IP3作用于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmicreticulum，ER)或肌漿網(wǎng)(sacroplasmicreticulum，

3、SR)，引起鈣庫(kù)釋放Ca2+。當(dāng)鈣庫(kù)耗竭，誘發(fā)細(xì)胞膜上某種Ca2+通道的開(kāi)放而促進(jìn)胞外Ca2+內(nèi)流，使鈣庫(kù)重新充盈，這種Ca2+通道被定義為鈣庫(kù)操縱性通道(store-operatedCa2+channel，SOCC)，該通道介導(dǎo)的Ca2+內(nèi)流稱(chēng)為庫(kù)容性Ca2+內(nèi)流(capacitativecalciumentry，CCE)。既往的研究發(fā)現(xiàn)VOCC是介導(dǎo)豚鼠遠(yuǎn)端結(jié)腸平滑肌收縮的主要機(jī)制，但對(duì)于SOCC是否存在于遠(yuǎn)端結(jié)腸平滑肌細(xì)胞上，以及

4、其生理功能為何尚不清楚，本研究在以往對(duì)結(jié)腸動(dòng)力研究的基礎(chǔ)上，應(yīng)用細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度測(cè)定和生物換能技術(shù)，從細(xì)胞和組織器官水平觀察大鼠遠(yuǎn)端結(jié)腸平滑肌細(xì)胞上SOCC，分析CCE在影響或控制遠(yuǎn)端結(jié)腸平滑肌動(dòng)力信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用，并對(duì)CCE是否參與乙酰膽堿(ACh)誘導(dǎo)的遠(yuǎn)端結(jié)腸平滑肌收縮作了初步探討。 1大鼠遠(yuǎn)端結(jié)腸平滑肌細(xì)胞上的SOCC 用[Ca2+]i變化為指標(biāo)，研究了毒胡蘿卜素(TG)和咖啡因(CAF)對(duì)酶解分離的大鼠遠(yuǎn)端結(jié)

5、腸平滑肌細(xì)胞[Ca2+]i的影響。在無(wú)Ca2+緩沖液中，TG(1μmol·L-1)以及CAF(10mmol·L-1)分別使[Ca2+]i由靜息時(shí)68.32±3.43nmol·L-1升高到240.85±12.65nmol·L-1、481.25±34.77nmol·L-1。繼之，向細(xì)胞外液中引入兩種濃度的Ca2+(1.5mmol·L-1和3.0mmol·L-1)，可引起[Ca2+]i進(jìn)一步升高，分別為457.55±19.80nmol·L-1

6、、1005.93±54.62nmol·L-1；643.88±34.65nmol·L-1、920.16±43.25nmol·L-1。且上述升高效應(yīng)對(duì)維拉帕米(Ver)(5μmol·L-1)以及高濃度KCl(40mmol·L-1)引起的細(xì)胞膜去極化不敏感，但可被La3+(1mmol·L-1)抑制。上述結(jié)果提示，在酶解分離的大鼠遠(yuǎn)端結(jié)腸平滑肌細(xì)胞上，存在因胞內(nèi)鈣庫(kù)耗竭所激活的SOCC，為支持在電興奮性細(xì)胞上存在庫(kù)容性Ca2+內(nèi)流提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)

7、。 2CCE參與大鼠遠(yuǎn)端結(jié)腸平滑肌動(dòng)力變化的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo) 利用離體器官灌流、并通過(guò)張力換能器、數(shù)據(jù)采集分析系統(tǒng)測(cè)定遠(yuǎn)端結(jié)腸縱形肌的張力，觀察了CCE在大鼠遠(yuǎn)端結(jié)腸平滑肌動(dòng)力變化的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TG(10nmol·L-1～1μmol·L-1)誘導(dǎo)結(jié)腸縱形肌條產(chǎn)生持續(xù)的收縮，不同濃度TG引起的腸肌同步收縮反應(yīng)張力顯著不同。在無(wú)鈣Krebs液(包含1mmol·L-1EDTA)中用TG將肌條培養(yǎng)35min后，再加入Ca

8、2+(2.5mmol·L-1)，比未經(jīng)TG處理的肌條產(chǎn)生的收縮張力明顯提高(99±28％vs70±8％)，且TG耗竭胞內(nèi)鈣庫(kù)后再?gòu)?fù)鈣所致的收縮效應(yīng)，不受L型鈣通道阻斷劑Ver影響，但可被SOCC阻斷劑La3+減弱。提示TG耗竭胞內(nèi)鈣庫(kù)后再?gòu)?fù)鈣誘導(dǎo)的大鼠遠(yuǎn)端結(jié)腸平滑肌收縮反應(yīng)由CCE介導(dǎo)，由此推測(cè)CCE是大鼠遠(yuǎn)端結(jié)腸平滑肌收縮的激活信號(hào)Ca2+的來(lái)源之一，參與完成結(jié)腸平滑肌興奮-收縮耦聯(lián)過(guò)程。 3CCE參與ACh誘導(dǎo)的大鼠遠(yuǎn)端結(jié)腸

9、平滑肌收縮 以無(wú)鈣的Krebs液灌流或用EGTA螯合細(xì)胞外Ca2+后，高K+及ACh引起的遠(yuǎn)端結(jié)腸平滑肌收縮幾乎完全消失。電壓操縱性Ca2+通道阻斷劑Ver也能減弱高K+及ACh引起的遠(yuǎn)端結(jié)腸平滑肌收縮，其減弱的程度分別為74％，41％。此外，在無(wú)鈣的Krebs液中，5μmol·L-1ACh可引起離體腸管瞬時(shí)性收縮，這是由SR釋放鈣所致，然后加入10μmol·L-1阿托品(atropine)，在此基礎(chǔ)上恢復(fù)細(xì)胞外Ca2+(2.5

10、mmol·L-1)，則出現(xiàn)持續(xù)性收縮，待收縮反應(yīng)達(dá)峰值時(shí)，加入5μmol·L-1Ver，收縮無(wú)明顯變化，且該收縮反應(yīng)對(duì)SOCC阻斷劑La3+敏感，分別應(yīng)用20μmol·L-1，50μmol·L-1和100μmol·L-1的La3+使上述收縮張力降低15％，23％和36％，且呈濃度依賴(lài)性，但對(duì)Cd2+則不敏感。研究結(jié)果提示，細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流對(duì)高K+及ACh誘導(dǎo)的離體遠(yuǎn)端結(jié)腸平滑肌持續(xù)性收縮是必需的，由ACh誘導(dǎo)的遠(yuǎn)端結(jié)腸平滑肌收縮至少包

11、括SR釋放鈣引起的短暫性收縮及受體操縱性Ca2+通道(receptor-operatedCa2+channel，ROCC)、VOCC和CCE介導(dǎo)的胞外Ca2+內(nèi)流等途徑。 總之，在大鼠遠(yuǎn)端結(jié)腸平滑肌細(xì)胞上，存在由胞內(nèi)鈣庫(kù)耗竭激活的SOCC，為支持在興奮性細(xì)胞上存在CCE提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。目前推測(cè)，瞬時(shí)受體電位(transientreceptorpotential，TRP)蛋白家族中的成員組成了SOCC。本研究證明CCE是結(jié)腸平滑肌

12、收縮的激活信號(hào)Ca2+的來(lái)源之一，參與完成結(jié)腸平滑肌興奮-收縮耦聯(lián)過(guò)程，在影響和調(diào)節(jié)結(jié)腸平滑肌動(dòng)力變化的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起重要作用，我們還發(fā)現(xiàn)細(xì)胞外Ca2+對(duì)高K+及ACh介導(dǎo)的結(jié)腸平滑肌收縮反應(yīng)是必需的，ACh誘導(dǎo)的結(jié)腸平滑肌收縮反應(yīng)至少包括SR釋放鈣引起的短暫性收縮及ROCC、VOCC和CCE介導(dǎo)的胞外Ca2+內(nèi)流引起的收縮反應(yīng)等途徑。經(jīng)研究結(jié)果將從通道水平進(jìn)一步分析消化管平滑肌收縮的機(jī)制和特征，為預(yù)防和控制因胃腸動(dòng)力紊亂所致的消化管疾病