Rho-Rho激酶抑制劑對(duì)大鼠肺動(dòng)脈高壓肺血管重構(gòu)的影響及其機(jī)制研究.pdf

1、 目的：采用左肺切除+野百合堿(MCT)項(xiàng)背部皮下注射建立大鼠肺動(dòng)脈高壓動(dòng)物模型,探討大鼠肺動(dòng)脈高壓肺血管和心室重構(gòu)的特點(diǎn),以及Rho/Rho激酶在轉(zhuǎn)錄水平的變化及其活性對(duì)肺高壓肺血管重構(gòu)的影響；探討Rho/Rho激酶抑制劑法舒地爾不同給藥方案對(duì)大鼠肺動(dòng)脈高壓肺血管重構(gòu)的作用及其機(jī)制,為法舒地爾(fasudil)的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法：1、將60只健康雄性SD大鼠(300-350g)隨機(jī)分為5組(每組12只),即C組：空白對(duì)照組

2、,不給與任何處理；J組：假手術(shù)組,手術(shù)暴露左側(cè)胸腔同左肺切除手術(shù)相同時(shí)間；M組：模型組,左肺切除+野百合堿(MCT,60mg/kg) 項(xiàng)背部皮下注射；F1組：左肺切除+MCT注射,于術(shù)后21d給與fasudil (2mg/kg.d )尾靜脈注射, 每日一次；F2組：左肺切除+MCT注射,于術(shù)后7d給與fasudil (2mg/kg.d )尾靜脈注射, 每日一次。2、術(shù)后35d,大鼠腹腔注射10%水合氯醛(0.04ml/kg)進(jìn)行麻醉,經(jīng)

3、右側(cè)頸外靜脈插管,測(cè)定各組大鼠平均肺動(dòng)脈壓力(mPAP)。3、脫頸法處死動(dòng)物后取下心臟,完整分離右心室游離壁(RV)和左心室+室間隔(LV+S),計(jì)算RV/(LV+S)比值了解心室重構(gòu)情況。4、各組大鼠肺組織行HE染色、SM-α-actin免疫組化染色和Elastin-Van Gieson染色,觀察肺血管和肺組織的病理學(xué)改變,并計(jì)算非肌性血管肌化程度、肺小動(dòng)脈新生內(nèi)膜增殖度、平 均血管阻塞計(jì)分、肺小動(dòng)脈中膜厚度百分比等體視學(xué)指標(biāo)。5、應(yīng)

4、用RT-PCR檢測(cè)各組大鼠肺組織ROCK1和ROCK2 mRNA相對(duì)表達(dá)水平的變化。6、采用Western blot檢測(cè)各組大鼠肺組織p-MYPT表達(dá)量變化,以了解Rho激酶活性的變化對(duì)肺血管重構(gòu)的影響。結(jié)果：1、M組大鼠在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中均出現(xiàn)不同程度的體重不增甚至下降、松毛、活動(dòng)減少、呼吸急促等。M組有5只死亡,F1組有1只死亡,其余組無(wú)死亡,上訴情況表現(xiàn)輕微。2、與C組和J組大鼠比較,M組大鼠的mPAP顯著升高[(58.56±3.56

5、vs. 22.36±1.75 and 23.31±1.51) mmHg], 差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；給與法舒地爾干預(yù)后,與M組大鼠比較,F1組和F2組大鼠mPAP均較M組有不同程度下降[(39.99±4.10 and 34.76 ±7.36 vs. 58.56±3.56) mmHg], 差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.01),且F2組下降更加明顯,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05)。3、與C組和J組大鼠比較, M組大鼠RV/

6、(LV+S)比值分別較C組和J組顯著增高(0.61 ± 0.08 vs. 0.29±0.04 and 0.31±0.04), 差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；給與法舒地爾干預(yù)后,與M組比較,F1組和F2組大鼠RV/(LV+S)比值均有不同程度下降(0.46±0.07 and 0.36±0.08 vs. 0.61±0.08), 差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),且F2組下降更加明顯,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。4、肺組織體視

7、學(xué)指標(biāo)檢測(cè),與C組和J組比較,M組WT%、WA%、無(wú)肌性血管肌化程度、新生內(nèi)膜增殖度、VOS顯著增高、LA%顯著降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；給與法舒地爾干預(yù)后,與M組比較,F1組和F2組大鼠WT%、WA%、非肌性小動(dòng)脈肌化程度、新生內(nèi)膜增殖度和VOS明顯下降,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001),且F2組降低更加明顯(P<0.001)。5、應(yīng)用RT-PCR檢測(cè)方法顯示M組大鼠ROCK1和ROCK2 mRNA表達(dá)水平明顯高

8、于C組和J組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)； 給與法舒地爾干預(yù)后,與M組比較,F1組和F2組的ROCK1和ROCK2 mRNA的表達(dá)水平均受到明顯抑制,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),且F2組下降更明顯(P<0.05)。6、應(yīng)用Western blot檢測(cè)方法顯示,M組肺組織p-MYTP表達(dá)水平明顯高于C組和J組(1.44±0.15 vs. 0.80±0.01 and 0.80±0.04,P<0.0001)。給與法舒地爾干預(yù)后,

9、F1組和F2組的p-MYTP表達(dá)水平均較M組明顯下降(1.05 ± 0.01 vs. 0.78±0.03 and 1.44±0.15,P<0.0001),且F2組下降更加明顯(P<0.001)。結(jié)論：1、左肺切除+MCT注射建立的大鼠肺動(dòng)脈高壓模型,出現(xiàn)了梗阻性肺動(dòng)脈高壓典型肺血管重構(gòu)的病理特征,并能誘導(dǎo)新生內(nèi)膜形成。2、法舒地爾可通過(guò)抑制ROCK1和ROCK2 mRNA的表達(dá)水平和Rho激酶活性對(duì)左肺切除+MCT誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈高壓大鼠肺