胎盤血管內皮細胞自噬在妊娠期肝內膽汁淤積癥的作用及機制.pdf

1、背景和目的:
　　妊娠期肝內膽汁淤積癥（intrahepatic cholestasis of pregnancy, ICP）易導致胎兒急性宮內窘迫甚至突然死亡，其病理生理機制不明，常規(guī)的產前監(jiān)測無法預測。故進一步研究ICP病理生理機制，認識ICP導致胎兒死亡的原因，是預防ICP不良妊娠結局的關鍵。
　　我們的前期研究發(fā)現(xiàn)ICP死胎的胎盤小血管中存在血栓及再通形成的現(xiàn)象，故提出假說:ICP孕母血液中升高的膽酸引起了胎盤血管內

2、皮細胞功能障礙，促使血栓形成，微循環(huán)障礙，嚴重影響母胎氧氣和營養(yǎng)物質交換，引起胎兒急性宮內窘迫甚至發(fā)生胎兒死亡。即ICP死胎的發(fā)生可能與膽酸引起的胎盤血管內皮細胞功能障礙有關。
　　為驗證上述假說，我們進行以下實驗:①觀察ICP胎盤組織學及超微結構的變化;②免疫組織化學法檢測ICP與正常胎盤自噬相關蛋白LC3A/B與血栓形成相關蛋白vWF的表達;③利用體外細胞模型觀察膽酸對人血管內皮細胞的影響。
　　材料與方法:
　　

3、1.體內試驗:
　?、買CP胎盤組織學觀察:收集1999年1月～2012午12月浙江大學醫(yī)學院附屬婦產科醫(yī)院病理科收藏的有完整臨床資料的ICP死胎的胎盤的檔案蠟塊13例，設為ICP死胎組。選擇浙江大學醫(yī)學院附屬婦產科醫(yī)院活胎分娩的孕婦共40例，其中ICP胎兒活產孕婦20例（ICP活胎組），健康孕婦正常分娩20例為正常妊娠組。光學顯微鏡下觀察各組胎盤組織石蠟切片的HE染色玻片，統(tǒng)計各組胎盤梗死、合體結節(jié)細胞增多、絨毛干血管血栓形成及

4、再通發(fā)生的比例。
　?、贗CP胎盤超微結構觀察:應用透射電鏡掃描觀察ICP活胎組與正常妊娠組人胎盤組織中血管內皮細胞的超微結構改變。
　　③免疫組織化學法研究:根據(jù)前期結果，通過免疫組化法檢測ICP與正常胎盤自噬相關蛋白LC3A/B與血栓形成相關蛋白vWF的表達。
　　2.細胞模型研究
　?、儆貌煌瑵舛忍荻?0～100uM)的甘膽酸處理人血管內皮細胞株(HUVEC)24小時。
　　②透射電鏡掃描觀察甘膽酸處

5、理的HUVEC超微結構的變化。
　?、弁ㄟ^蛋白免疫印跡方法檢測HUVEC自噬相關蛋白LC3Ⅱ與beclin-1的表達量。
　　結果:
　　1.ICP胎盤組織學變化:
　?、僬Ｈ焉锝M2例有局灶性合體細胞結節(jié)增多，未見到梗死、底蛻膜血腫及血栓形成。
　?、贗CP活胎組20例胎盤病理檢查，其中10例有局灶性合體細胞結節(jié)增多，7例有梗死，4例見到底蛻膜血腫，1例見到絨毛膜下血栓。
　　③ICP死胎組13例胎

6、盤病理檢查均有局灶性合體細胞結節(jié)增多，其中5例可見梗死伴有小區(qū)鈣化、絨毛退行性交，5例遠端絨毛干血管中可見血栓形成及再通。
　　2.ICP胎盤組織血管內皮細胞超微結構變化:
　　正常組胎盤組織中血管內皮細胞內可見W-P小體與大量彈力纖維;ICP活胎組胎盤組織中血管內皮細胞內亦可見到W-P小體與大量彈力纖維，同時可見到自噬小體明顯增多，并有向血管腔內分泌的趨勢。
　　3.ICP胎盤自噬相關蛋白LC3 A/B與血栓形成相關

7、蛋白vWF的變化
　　(1) LC3蛋白主要表達于胎盤血管內皮細胞、血管壁平滑肌細胞及胎盤滋養(yǎng)細胞的胞漿。正常妊娠組胎盤血管內皮細胞表達較弱或者不表達。與正常妊娠組比較，ICP活胎組、ICP死胎組胎盤組織的血管內皮細胞中，LC3蛋白表達遞次增加，三組間的比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.001)。
　　(2) vWF因子主要表達于胎盤血管內皮細胞的胞漿，正常妊娠組胎盤血管內皮細胞表達較弱。與正常妊娠組比較，ICP活胎組、ICP死

8、胎組胎盤組織中vWF因子表達明顯增加，三組間的比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.001)。ICP死胎組可見絨毛干的血管中，VWF因子在血栓形成并再通的血管內皮細胞上強表達。
　　(3)胎盤血管內皮細胞LC3A/B與VWF的表達呈正相關(r=0.65，P＜0.001)。
　　4.甘膽酸對HUVEC超微結構的影響:
　　用100 uM甘膽酸與HUVEC細胞共培養(yǎng)24小時，透射電鏡掃描觀察到HUEVC細胞內自噬小體較對照組明顯增

9、多。
　　5.甘膽酸對HUVEC細胞LC3B-Ⅱ、Beclin-1蛋白表達的影響。
　　不同濃度(0～100uM)的甘膽酸作用24小時后，HUVEC的LC3B-Ⅱ、Beclin-1表達量隨甘膽酸濃度的增加而逐漸增加。其中100uM組LC3B-Ⅱ的表達量顯著高于對照組(P＜0.01)。
　　結論:
　　1.ICP死胎組胎盤血管存在血栓及再通現(xiàn)象，提示血栓形成可能是ICP胎兒窘迫甚至死胎發(fā)生時胎盤重要的病理變化之一。