Cripto-1和β-catenin蛋白表達(dá)與胃癌發(fā)生和轉(zhuǎn)移的關(guān)系及意義.pdf

1、目的：
　　 檢測(cè)正常胃黏膜、慢性萎縮性胃炎、腸上皮化生、異型增生及胃癌組織中Cripto-1和β-catenin蛋白的表達(dá)，分析兩者表達(dá)的差異性和相關(guān)性，并探討二者表達(dá)與胃癌發(fā)生和轉(zhuǎn)移的關(guān)系及意義。
　　 方法：
　　 臨床病例資料收集及組織芯片制作：收集中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腫瘤外科手術(shù)切除胃癌標(biāo)本192例（其中117例距癌灶邊緣大于5cm處取配對(duì)正常胃黏膜作為對(duì)照），慢性萎縮性胃炎42例，腸上皮化生54例

2、及異型增生25例。常規(guī)石蠟包埋，組織蠟塊行4um組織切片，常規(guī)HE染色，用于目標(biāo)組織的定位。采用組織芯片制作儀構(gòu)建胃癌及癌前病變組織芯片蠟塊，行4um連續(xù)切片。另取，32例新鮮原發(fā)胃癌組織及其配對(duì)遠(yuǎn)癌正常胃黏膜組織（距癌灶邊緣大于5cm），術(shù)中切除后立即放入-80℃冰箱，保存?zhèn)溆谩?br>　　 免疫組化染色及結(jié)果判定方法：采用PV-9000免疫組化二步法檢測(cè)正常胃黏膜、慢性萎縮性胃炎、腸上皮化生及胃癌中Cripto-1和β-catcn

3、in蛋白的表達(dá)。鼠抗人Cripto-1單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)R&D公司，工作濃度為1:80，兔抗人β-catenin多克隆抗體購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司，工作濃度1:50，免疫組化及DAB顯色試劑盒購(gòu)自北京中杉生物有限公司。用PBS代替一抗做陰性對(duì)照。結(jié)果判定：Cripto-1和β-catenin蛋白在細(xì)胞漿呈現(xiàn)清晰棕黃色特異性免疫反應(yīng)顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞。每一病例隨機(jī)選擇2個(gè)高倍鏡視野，計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，陽(yáng)性細(xì)胞占計(jì)數(shù)同類細(xì)胞百分率<5％為

4、0分，5％～25％為1分，26％～50％為2分，51％～75％為3分，>75％為4分。染色強(qiáng)度以陽(yáng)性細(xì)胞呈色反應(yīng)為準(zhǔn)：無(wú)特異著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；然后按染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞所占的百分比的乘積將結(jié)果分為：0分為陰性（-）；1～4分為弱陽(yáng)性（+）；5～8分為中度陽(yáng)性（++），9～12分為強(qiáng)陽(yáng)性（+++）。
　　 蛋白免疫印跡與結(jié)果判定：分別取凍存的不同胃癌及正常胃黏膜組織各30mg，分別加入300ul裂

5、解液。超聲粉碎后置于冰上30min，12000r/min離心10min，取上清液經(jīng)Bradford法定量組織蛋白。加入上樣緩沖液變性，每孔50ug。制備SDS凝膠，加樣后120V電泳。恒定電壓100V下轉(zhuǎn)膜2小時(shí)，室溫封閉1小時(shí)。用TBST將Cripto-1一抗稀釋至1:300，β-catenin一抗稀釋至1:500，倒入已放好膜的孵育袋中4℃過(guò)夜。用TBST配制按1:10000配制二抗，室溫下孵育2h，進(jìn)行ECL發(fā)光。結(jié)果判定：采用凝

6、膠成像分析系統(tǒng)對(duì)雜交條帶進(jìn)行半定量分析，蛋白含量以積分光密度值表示。每次檢測(cè)時(shí)都檢測(cè)β-actin內(nèi)參蛋白，用Cripto-1或β-catenin蛋白與β-actin的比值作為目的蛋白相對(duì)表達(dá)水平。
　　 結(jié)果：
　　 Cripto-1蛋白在慢性萎縮性胃炎（69.0％）、腸上皮化生（83.3％）、異型增生（80.0％）和胃癌組織（72.4％）中表達(dá)的陽(yáng)性率均顯著高于正常胃黏膜（47.9％），P<0.05；胃癌Lauren

7、分型中，Cripto-1蛋白在腸型胃癌中的陽(yáng)性表達(dá)率（84.0％）顯著高于彌漫型胃癌（67.4％），P<0.05。中分化管狀腺癌中Cripto-1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率（85.7％）顯著高于低分化腺癌（63.5％），P<0.05。伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移胃癌組Cripto-1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率（76.6％）顯著高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（60.8％），P<0.05。Cripto-1表達(dá)與胃癌患者性別、年齡及胃癌大體分型無(wú)顯著相關(guān)，P>0.05。Western blot

8、實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Cripto-1在胃癌組中的表達(dá)水平（95.19±29.68）顯著高于正常胃黏膜組（78.04±29.02），t=2.338，P=0.023。
　　 β-catenin蛋白在慢性萎縮性胃炎（59.5％）、腸上皮化生（72.2％）、異型增生（64.0％）和胃癌組織（57.3％，）中表達(dá)的陽(yáng)性率均顯著高于正常胃黏膜（30.9％），P<0.01；腸上皮化生組中β-catenin蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率高于胃癌組，P<0.05。伴

9、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移胃癌組β-catenin蛋白陽(yáng)性表達(dá)率（64.8％）顯著高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（51.7％），P<0.05。Lauren分型中β-catenin蛋白在腸型胃癌組中的陽(yáng)性表達(dá)率（64.6％）高于彌漫型胃癌組中的表達(dá)率（51.7％），但未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P=0.07。β-catenin蛋白表達(dá)與胃癌患者性別、年齡、胃癌大體分型、WHO組織學(xué)分型及Lauren分型無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性，P>0.05。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，β-ca

10、tenin的表達(dá)水平在胃癌組（115.97±27.521）與正常胃黏膜組（105.95±23.353）間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，t=1.571，p=0.122。
　　 192例胃癌組織中Cripto-1和β-catenin蛋白表達(dá)呈正相關(guān)，等級(jí)相關(guān)系數(shù)，rk=0.220，P<0.001。
　　 結(jié)論：
　　 Cripto-1與β-catenin蛋白在胃癌前病變及胃癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率均顯著高于正常胃黏膜，提示二者可能作為致