生物熒光成像與人嗜中性粒細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)動力學(xué)的研究.pdf

1、耗散結(jié)構(gòu)理論在物理、化學(xué)、生物乃至社會等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用，尤其是近年來在生命科學(xué)研究中的應(yīng)用更是得到了重視，如在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)調(diào)控、免疫系統(tǒng)防御與殺傷調(diào)控、胚胎發(fā)育調(diào)控等研究。在本論文中，我們以耗散結(jié)構(gòu)理論為指導(dǎo)，開展了人嗜中性粒細胞內(nèi)煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(磷酸)[Hydrogenated Nicotinamide Adenine Dinucleotide(Phosphate)，NAD(P)H]和鈣(Ca2+)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)動力學(xué)的研究。<

2、br>　　 人嗜中性粒細胞是免疫系統(tǒng)重要組成之一，其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)動力學(xué)過程具有耗散現(xiàn)象，如已發(fā)現(xiàn)NAD(P)H和Ca2+信號在細胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程呈現(xiàn)時空有序性的耗散模式。目前，活體細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中時空信息的有效獲取主要依賴于活體熒光成像技術(shù)。因此我們構(gòu)建了顯微弱光高時空分辨率成像系統(tǒng)，可實現(xiàn)毫秒級信號連續(xù)采集，同時保證空間信息的獲取。依托該系統(tǒng)，本論文在單個嗜中性粒細胞水平上研究了NAD(P)H自體熒光的探測問題，最終克服了NAD(P)H

3、自體熒光強度較弱、易漂白淬滅，以及紫外激發(fā)光對細胞光毒性影響等難題，實現(xiàn)了該熒光信號在單個嗜中性粒細胞水平上的實時、快速、可視化成像，從而為研究單個嗜中性粒細胞內(nèi)NAD(P)H信號轉(zhuǎn)導(dǎo)動力學(xué)過程中的時空信息提供高時空分辨實驗平臺和有效技術(shù)支持。
　　 在此基礎(chǔ)上，我們系統(tǒng)地研究了外源性一氧化氮(Nitric Oxide，NO)對佛波酯(Phorbol12-Myristate13-Acetate，PMA)激活的人嗜中性粒細胞內(nèi)Ca

4、2+動力學(xué)過程的影響。作為一種重要免疫信使分子，NO對嗜中性粒細胞趨化、粘附、呼吸爆發(fā)等生理功能的行使發(fā)揮著重要作用。同時，PMA是蛋白激酶C(ProteinKinase C，PKC)的特異性激動劑，可通過激活NAD(P)H氧化酶誘導(dǎo)嗜中性粒細胞呼吸爆發(fā)。我們的研究結(jié)果首次證明了外源性：NO是通過亞硝基化反應(yīng)途徑誘導(dǎo)人嗜中性粒細胞內(nèi)IP3受體敏感的鈣庫釋放，而不是通過傳統(tǒng)的NO-sGC—cGMP信號途徑，鈣庫釋放可誘導(dǎo)明顯的胞外鈣內(nèi)流，

5、且整個過程是依賴于PMA誘導(dǎo)人嗜中性粒細胞的呼吸爆發(fā)。該發(fā)現(xiàn)為臨床上使用外源性NO治療相關(guān)免疫類疾病提供了嶄新的思考視角及實驗支持，也為研究細胞內(nèi)Ca2+信號耗散現(xiàn)象提供了實驗?zāi)Ｐ汀?br>　　 此外，我們還應(yīng)用PMA對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎模型的大鼠滑膜細胞進行了一定研究。類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)病機制與嗜中性粒細胞異常增殖密切相關(guān)。我們利用原子力顯微成像術(shù)，使用PMA刺激滑膜細胞模擬炎癥過程，結(jié)果顯示PMA可以誘導(dǎo)大鼠關(guān)節(jié)炎模型的大鼠滑膜細胞骨架的明