基于2b-RAD技術(shù)的家蠶BmNPV抗性遺傳的研究.pdf

1、家蠶是鱗翅目模式昆蟲，也是重要的經(jīng)濟(jì)昆蟲，蠶絲具有很高的經(jīng)濟(jì)價值，是很多地區(qū)農(nóng)民的主要收入來源。但是，家蠶病害的發(fā)生也給桑蠶業(yè)帶來了極大困擾，嚴(yán)重制約了蠶桑產(chǎn)業(yè)的穩(wěn)定發(fā)展。病毒病是蠶業(yè)生產(chǎn)上危害最大的疾病，其中家蠶核型多角體病毒（Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus，BmNPV）引起的血液型膿病危害最大，約占蠶病損失的70％，該病目前尚無法治療。因此從生產(chǎn)和安全方面來講，家蠶核型多角體病毒抗性基因

2、的尋找和抗性品種的培育都是一項重要工作。
　　本課題采用抗BmNPV蠶品種華康2號一代雜交種來源的抗性品系A(chǔ)N、抗BmNPV蠶品種野三元N中的抗性親本野BN和易感性品系C108作為研究材料，在明確供試蠶品種對 BmNPV抵抗力的基礎(chǔ)上，構(gòu)建抗性遺傳分離群體，利用2b-RAD分析技術(shù)，探索AN、野BN品種的BmNPV抗性遺傳機制，主要實驗內(nèi)容和結(jié)果如下：
　　1.家蠶AN、野BN與C108品系的BmNPV抗性鑒定
　　抗

3、性品系 AN在2齡起蠶 BmNPV多角體添食的半數(shù)致死濃度（LC50）為2.154×109個/mL、半數(shù)致死劑量（LD50）為1.436×107個/頭蠶。野 BN在添食BmNPV病毒多角體濃度達(dá)到1×108/mL時才發(fā)生蠶體死亡，野BN的LD50為2.5×107個/頭蠶。感性品種 C108接種病毒后發(fā)病率很高，當(dāng)多角體濃度達(dá)到1×107時全部死亡，半數(shù)致死濃度（LC50）低至1.239×105個/mL，LD50為8.266×102個/頭

4、蠶。抗性品系A(chǔ)N及野BN與感性品系C108間的LD50差距都達(dá)到104以上。因此，采用BmNPV多角體懸液濃度為1×108個/mL浸漬桑葉對2齡蠶進(jìn)行添毒12h，可以有效篩選出AN和野BN品系來源的BmNPV抗性基因攜帶個體。
　　2.家蠶AN品系與野BN品系BmNPV抗性基因的2b-RAD分析
　　1）2b-RAD標(biāo)記的分析
　　為了解析家蠶AN、野BN品種對BmNPV抗性的遺傳機制，用易感品種C108作為回交親本分

5、別構(gòu)建兩品種的BC4M[C108×((((AN×C108)×C108)×C108)×C108)]和BC3M[C108×(((野BN×C108)×C108)×C108)]遺傳分離群體。對2個遺傳分離群體通過2齡期起蠶進(jìn)行1×108個/mL NPV多角體懸液浸漬桑葉添毒12h，常規(guī)飼養(yǎng)7d后存活個體作為抗性分離群體。對3個親本和2個抗性分離群體的基因組DNA構(gòu)建2b-RAD文庫并進(jìn)行Illumina測序。獲得可區(qū)分AN品系與C108品系間差

6、異的多態(tài)性SNP標(biāo)記有11919個，；獲得可區(qū)分野BN與C108品系間差異的多態(tài)性SNP標(biāo)記12293個。SNP分子標(biāo)記主要分布于內(nèi)含子（44.13%）、基因間（21.92%）、基因下游（12.12%）和上游（11.09%）及外顯子（8.82%）區(qū)域，基因編碼區(qū)內(nèi)的SNP同義突變、錯義突變和無義突變的比例分別為82.03%、17.70%和0.27%。子代1與子代2之間的結(jié)果無明顯差異。
　　2）AN和野BN品系抗性來源在染色體的分

7、布與抗病貢獻(xiàn)率的分析
　　采用下列公式計算代表每個多態(tài)性位點相應(yīng)的BmNPV抗性關(guān)聯(lián)度的SNP-index：SNP-index=抗性品系類型SNP檢出頻次/（感性品系類型SNP檢出頻次+抗性品系類型SNP檢出頻次）。對基因組序列以500Kb劃窗、5Kb步移計算SNP-index平均值折線圖，以每個染色體的折線與橫坐標(biāo)之間的面積代表各染色體對BmNPV抗性的貢獻(xiàn)，各染色體SNP-index折線面積占全基因組SNP-index折線總面

8、積的百分率作為各染色體的抗性貢獻(xiàn)率?？剐苑蛛x群體全基因組BmNPV抗性關(guān)聯(lián)的SNP-index分析表明，AN、野BN品種的BmNPV抗性相關(guān)標(biāo)記位于多個染色體上，AN品系抗性貢獻(xiàn)率前5位的是第5、10、27、23和4號染色體，野BN品種抗性貢獻(xiàn)率前5位的是第4、27、15、18和6號染色體。多個SNP-index高值位點與已報道的BmNPV抗性相關(guān)基因的位置具有較高的對應(yīng)性。推測AN、野BN品系BmNPV高抗性與抗性主基因及其他抗性基因

9、的聯(lián)合作用有關(guān)。
　　3.家蠶AN品系與野BN品系BmNPV抗性差異的初步分析
　　1）基于各染色體貢獻(xiàn)率的差異分析
　　家蠶AN品系與野BN品系的BmNPV抗性與27號染色體連鎖，并且在兩個品系的抗BmNPV的貢獻(xiàn)率中分別位于第3和第2位，這是屬于兩個品種的共性。3號染色體、7號染色體、8號染色體在兩個品系貢獻(xiàn)率的對比中差異較大，家蠶AN和野BN品系中，Chr3的貢獻(xiàn)率分別為4.84%和2.29%、貢獻(xiàn)率排序分別為第

10、9位和第22位；Chr7的貢獻(xiàn)率分別是4.16%和1.44%，排序分別為第11位和第28位）；Chr8的貢獻(xiàn)率分別為1.06%和4.53%，排序分別為第26位和第9位。表明家蠶AN與野BN可能具有較大的遺傳血緣和抗性來源機制。
　　2）基于高值SNP-index的標(biāo)記個數(shù)的差異分析
　　在兩個品種的對比分析中，以SNP-index為0.5?0.2的多態(tài)性SNP標(biāo)記定義為NPV抗性高相關(guān)度標(biāo)記，各染色體NPV抗性高相關(guān)度標(biāo)記差

11、異個數(shù)占全基因組NPV抗性高相關(guān)度標(biāo)記差異總數(shù)的比例為依據(jù)進(jìn)行分析，得出Chr27、Chr03、Chr12、Chr16、Chr23、Chr25依次位于前6位，這6條染色體的NPV抗性高相關(guān)度標(biāo)記的差異總比例達(dá)到54.82%，說明第27、3、12、16、23、25這6個染色體在AN、野BN的BmNPV抗性方面占有重要地位，并且在這些染色體中存在兩個品種間抗性能力不同的抗性基因或過程。在這些染色體中的scaffold水平上分析發(fā)現(xiàn)：Bm_s