去極化時GSK-3β活性調控新機制.pdf

1、體外培養(yǎng)在含高濃度KCI([KCI]o=25 mM,25 K)培養(yǎng)基的小腦顆粒神經元(cerebellar granule neurons,CGNs)很好模擬了在小腦發(fā)育過程CGNs發(fā)生去極化并遷移分化成熟的現(xiàn)象。高濃度KCI(25 K)模擬了體內的“電活性”,使CGN處于去極化狀態(tài),從而維持CGNs存活并促使其分化成熟。我們發(fā)現(xiàn)去極化(25K)時糖原合成激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β)

2、活性被抑制并介導了神經元存活,但具體機制仍不清楚。這里,我們的研究發(fā)現(xiàn)GSK-3β活性的抑制能被L-型鈣通道拮抗劑nifedipine及calmodulin(CaM)抑制劑W-13恢復,表明去極化時Ca2+/CaM介導了GSK-3β活性的抑制。我們通過抑制劑實驗及體外激酶反應證實Ca2+/CaM激活下游激酶CaMKⅡ,CaMKⅡ磷酸化GSK-3β關鍵的抑制性磷酸化位點Ser9。但CaMKⅡ抑制劑CaMKⅡNtide抑制GSK-3βSer

3、9的磷酸化后并不能完全恢復GSK-3β活性；進一步,我們的雙向電泳及免疫耗竭實驗表明去極化時有一部分(約65％)GSK-3β并不受Ser9磷酸化調控,以上結果提示其它方式參與了去極化對GSK-3β活性的調控。在這里,我們發(fā)現(xiàn)Ca2+/CaM可直接與GSK-3β相互作用,CaM—S4B pull down及免疫共沉淀實驗都證實GSK-3β與CaM呈鈣依賴相互作用；通過GSK-3β續(xù)減分析,我們確定GSK-3β的60-120位氨基酸是與Ca

4、M結合的關鍵區(qū)域,去除這一段后GSK-3β與CaM的結合明顯減弱。此外,我們通過雙分子熒光互補分析(Bimolecular FluorescenceComplementation assay,BiFC)觀察到GSK-3β與CaM在細胞內形成BiFC信號,去除兩者相互作用區(qū)域化后BiFC信號明顯減弱,證實GSK-3β與CaM能在細胞內相互作用。
　　 最后,激酶反應結果表明CaM能呈濃度依賴性抑制GSK-3β活性。因此,我們的研究