大菱鲆紅體病虹彩病毒的核酸探針檢測(cè)及病毒感染牙鲆鰓細(xì)胞系的研究.pdf

1、大菱鲆(Scophthalmus maximus)是優(yōu)質(zhì)的海水魚(yú)類(lèi)養(yǎng)殖品種，近年來(lái)大菱鲆的工廠(chǎng)化養(yǎng)殖在我國(guó)北方沿海地區(qū)迅猛發(fā)展，成為我國(guó)北方重要的海水魚(yú)類(lèi)養(yǎng) 殖產(chǎn)業(yè)。然而，目前我國(guó)養(yǎng)殖大菱鲆的病害問(wèn)題卻越來(lái)越嚴(yán)重，已經(jīng)威脅其健康發(fā)展。2001年，在我國(guó)多個(gè)大菱鲆養(yǎng)殖場(chǎng)開(kāi)始流行一種可導(dǎo)致大菱鲆魚(yú)苗和養(yǎng)成魚(yú)大量死亡的疾病，患病和垂死的大菱鲆最主要的外觀(guān)特征是體表無(wú)明顯損傷，魚(yú)體無(wú)眼側(cè)(腹面)沿脊椎骨附近皮下淤血、發(fā)紅；患病嚴(yán)重時(shí)病魚(yú)鰭和鰭

2、基部也有彌散性出血，整個(gè)魚(yú)體腹面呈粉紅色。經(jīng)電鏡觀(guān)察，在病魚(yú)的鰓、腸、脾、腎等多個(gè)組織內(nèi)發(fā)現(xiàn)了一種似虹彩病毒(Iridovims-1ike)的嚴(yán)重感染。進(jìn)一步的研究表明，該病毒是一種新的魚(yú)類(lèi)虹彩病毒，暫命名為大菱鲆紅體病虹彩病毒(Turbot reddish body iridovirus，TRBIV)。 本研究針對(duì)該病病原大菱鲆紅體病虹彩病毒(TRBIV)建立了核酸探針檢測(cè)技術(shù)。應(yīng)用PCR技術(shù)制備了非放射性標(biāo)記物地高辛(DIG

3、)標(biāo)記的TRBIV DNA探針，通過(guò)核酸探針斑點(diǎn)雜交檢測(cè)方法對(duì)此探針特異性及靈敏度進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果表明其對(duì)TRBIV重組質(zhì)粒pGAPZaA-MCP的檢出靈敏度為2.095 pg，相當(dāng)于4.561×10<'5>個(gè)TRBIV重組質(zhì)粒pGAPZaA-MCP拷貝。可檢出48 ng患紅體病大菱鲆腎組織勻漿液、23 ng感染紅體病病毒的大菱鲆脾組織勻漿液，而與健康大菱鲆組織勻漿液和組織DNA，LCDV DNA均不發(fā)生交叉反應(yīng)。 大菱鲆虹彩病毒

4、(Turbot reddish body iridovirus，TRBIV)是虹彩病毒科，腫大細(xì)胞病毒(Megalocytivirus)，這個(gè)屬的病毒具有的特點(diǎn)是，不容易感染培養(yǎng)細(xì)胞，至今為止只有真鯛虹彩病毒感染培養(yǎng)細(xì)胞成功的報(bào)道(Oshima et al,1998)。而TRBIV作為一種新的魚(yú)類(lèi)虹彩病毒分離株，國(guó)內(nèi)外尚未有其敏感細(xì)胞系的研究報(bào)道。本論文開(kāi)展了大菱鲆紅體病病毒(TRBlV)感染牙鲆鰓細(xì)胞系(Flounder gill c

5、ell line，F(xiàn)G)的研究。FG細(xì)胞在接種TRBIV后出現(xiàn)了典型的細(xì)胞病變(Cytopathic effect，CPE)，通過(guò)電子顯微鏡對(duì)感染細(xì)胞進(jìn)行觀(guān)察，發(fā)現(xiàn)感染細(xì)胞中有病毒粒子，衣殼呈典型的六角形，核心大小為60～80 nm，在細(xì)胞內(nèi)空泡中發(fā)現(xiàn)大量的未完全裝配的空的病毒衣殼，這是在病毒復(fù)制過(guò)程中生成的。同時(shí)觀(guān)察到病毒通過(guò)裂解細(xì)胞而大量釋放。表明病毒在FG細(xì)胞中進(jìn)行了復(fù)制并完成了復(fù)制循環(huán)。在20℃和24℃培養(yǎng)條件下，對(duì)病毒的形態(tài)和