特異性阻斷肝癌癌蛋白P28-Gankyrin與Rb相互作用的小分子化合物的篩選和功能鑒定.pdf

1、研究背景和目的： Gankyrin是2000年日本科學(xué)家Fujita等人應(yīng)用消減雜交法從人肝細(xì)胞癌(Hepatocellular Carcinoma,HCC)組織高表達(dá)的基因中篩選出的一條編碼重復(fù)ankyrin(ANK)序列的新基因。我們檢索基因庫后發(fā)現(xiàn)gankyrin與1998年Hori等人發(fā)現(xiàn)的p28 (Nas6p)基因序列完全一致,遂將其命名為p28GANK。癌基因p28GANK編碼的蛋白是人26S蛋白酶體(26S pro

2、teasome)調(diào)節(jié)亞單位19S/PA700復(fù)合物的一種非ATP酶亞基,其核酸序列中含有5個串聯(lián)排列的ANK重復(fù)單位,其保守的ankyrin序列介導(dǎo)蛋白與蛋白間的相互作用。26S蛋白酶體中的20S蛋白小體是降解體內(nèi)某些錯誤折疊蛋白或細(xì)胞周期蛋白的場所,目前尚不清楚癌蛋白P28GANK在26S蛋白酶體降解蛋白過程中的具體分子作用機制。 前期研究發(fā)現(xiàn)癌蛋白P28-GANK通過與Rb的直接相互作用,調(diào)節(jié)Rb的磷酸化程度,此外,P28G

3、ANK與pRb結(jié)合后還可能通過26S蛋白酶體的S6bATP酶促進(jìn)pRb的降解；或pRb直接與26S蛋白酶體的20S核結(jié)合而介導(dǎo)其自身降解。通過以上多種途徑P28GANK調(diào)控CDK4/CyclinD1/p16INK4a/Rb1/E2F-1信號傳導(dǎo)通路,已知該信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在肝癌的發(fā)生發(fā)展過程中具有相當(dāng)重要的作用。因此,針對該通路及相關(guān)靶點采取干預(yù)措施有望成為肝癌治療的新途徑。本論文主要針對CDK4/CyclinD1/p16INK4a/Rb1

4、/E2F-1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中P28GANK和Rb的相互作用的關(guān)鍵區(qū)域和氨基酸,運用計算機輔助藥物設(shè)計程序設(shè)計特異性阻斷兩者結(jié)合的小分子化合物并對其進(jìn)行生物學(xué)功能鑒定。 計算機輔助藥物設(shè)計(CADD)涉及化學(xué)、生物學(xué)、計算機科學(xué)、信息學(xué)、數(shù)學(xué)和物理學(xué)等領(lǐng)域,是一門新興的、快速發(fā)展的邊緣學(xué)科。它基于藥物及其生物大分了靶標(biāo)的知識,通過理論模擬和計算來預(yù)測受體與配體間的相互作用,從而指導(dǎo)和輔助藥物設(shè)計,加快藥物開發(fā)進(jìn)程。隨著藥物設(shè)計理論和

5、方法的不斷發(fā)展和完善,CADD在藥物先導(dǎo)化合物發(fā)現(xiàn)和開發(fā)的過程中起到了日益重要的作用,目前已有不少成功的例子。因此,CADD已被公認(rèn)為是一種高效的藥物設(shè)計手段。前期研究顯示P28GANK主要通過N末端的LxCxE模序與pRb的C端產(chǎn)生特異相互作用,在這段序列進(jìn)行的突變實驗證實其能影響P28GANK與Rb的結(jié)合,而含有LxCxE的多肽也能阻斷P28GANK與Rb的作用,因此推測此處即為P28GANK與Rb的作用部位。 P28GAN

6、K的表面沒有合適的口袋或活性位點,而在Rb上與含有LxCxE模序多肽特異結(jié)合的部位有一個位處表面的口袋可用于先導(dǎo)化合物的設(shè)計篩選。所以我們選擇Rb作為藥物篩選的靶標(biāo),希望能夠找到特異性阻斷P28GANK和Rb結(jié)合的小分子化合物。 實驗方法： 1、運用生物信息學(xué)的方法在互聯(lián)網(wǎng)上尋找Rb的晶體結(jié)構(gòu),確定與P28GANK相互作用的空間結(jié)構(gòu)及關(guān)鍵氨基酸殘基,并設(shè)計虛擬篩選流程； 2、綜合考慮分子量、疏水性、氫鍵受體、氫鍵

7、供體、柔性鍵和環(huán)比度等各方面對含有約26萬個小分子的SPECS200603化合物庫進(jìn)行類藥性過濾； 3、將符合藥性規(guī)則的分子用DOCK4.0和Glide對接,各取得分排名靠前的10000個化合物,綜合兩者打分最好的1286個化合物； 4、用Autodock3.05進(jìn)行對接,選取前500個化合物,根據(jù)關(guān)鍵結(jié)合位點信息直接觀察挑選; 5、經(jīng)綜合評價,選擇100個化合物購買,并最終獲得71個化合物； 6、構(gòu)建p

8、28GANK-GST融合質(zhì)粒,在BL21大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)并純化GST和GST-P28GANK蛋白； 7、構(gòu)建Rb野生型和針對LxCxE與Rb結(jié)合口袋關(guān)鍵位點的突變體的真核表達(dá)質(zhì)粒； 8、各Rb突變體質(zhì)粒瞬轉(zhuǎn)293T細(xì)胞,并用GST-pulldown驗證這些位點在Rb和P28GANK結(jié)合中的關(guān)鍵性； 9、運用CCK-8的方法按不同的濃度梯度初篩有活性的小分子化合物； 10、對生物學(xué)活性比較好的化合物細(xì)化濃

9、度梯度,檢測其在不同的肝癌細(xì)胞系和正常細(xì)胞系中對細(xì)胞增殖的影響； 11、運用GST-pulldown方法驗證化合物能否抑制Rb與P28GANK的結(jié)合。 結(jié)果： 1、通過藥物設(shè)計程序確定Rb蛋白與P28GANK相互作用的結(jié)構(gòu)域(口袋)和關(guān)鍵氨基陵；運用Rb蛋白的突變體作GST-pulldown,證實構(gòu)成與p28GANK LxCxE序列結(jié)合口袋的709、713、753、756、757、761位點的突變能夠有效抑制Rb

10、與P28GANK的結(jié)合,其中,709和713位點尤為關(guān)鍵。 2、利用CADD虛擬篩選出大約100個小分子化合物,實際購買獲得71個。 3、利用CCK-8初步篩選出6號小分了化合物能有效地抑制肝癌綱胞的增殖且對正常細(xì)胞基本無影響,其EC50為3um,對穩(wěn)定表達(dá)P28GANK 的NIH/3T3-p28GANK細(xì)胞系有明確的抑制增殖活性,而對NIH/3T3-pcDNA3.1細(xì)胞系無作用。 4、通過GST-pulldow