基于多基因型戊型肝炎病毒混合抗原的ELISA IgM抗體捕獲法的建立及評價.pdf

1、[目的]HEV IgM抗體是急性戊型肝炎的診斷指標,目前其檢測方法的靈敏度和特異性急需提高.該實驗用辣根過氧化物酶標記多基因型HEV混合重組抗原,建立HEV ELISAIgM抗體捕獲法,以便為戊型肝炎實驗室診斷和流行病學調(diào)查提供簡便、靈敏、有效的檢測手段.[方法]1.以人IgM為抗原免疫小鼠,取免疫脾細胞與SP2/0細胞進行細胞融合.細胞融合后將抗體陽性雜交瘤細胞進行亞克隆,建立細胞株.小鼠體內(nèi)誘生腹水的方法制備抗人IgM單克隆抗體,辛

2、酸—硫酸銨鹽析法進行純化.2.將7種不同基因型和亞型的HEV重組抗原等量混合,過碘酸鈉法進行標記,硫酸銨鹽析法純化酶標記混合物,對酶標抗原進行質(zhì)量鑒定.3.用方陣滴定法在已制備的抗人IgM單克隆抗體中選擇包被抗體,并確定最佳抗體包被稀釋度和酶標抗原稀釋度,選擇合適的包被液、標本稀釋液、酶標抗原稀釋液、標本稀釋度,建立HEVIgM抗體捕獲法,并對其敏感性、特異性、穩(wěn)定性和重復性進行評價.[結(jié)果]1.獲得三株分泌抗人IgM單克隆抗體的雜交瘤

3、細胞株:M<,1>、M<,2>、M<,3>,其分泌的單克隆抗體經(jīng)亞類鑒定分別為IgG3、IgG2a和IgG1;將腹水抗體純化后經(jīng)SDS-PAGE電泳鑒定,在分子量為55KD和25KD處有蛋白帶,沒有雜蛋白條帶.2.HEV混合抗原辣根過氧化物酶標記后工作濃度為1:800;質(zhì)量鑒定:HRP含量=0.42mg/ml;HEVAg含量=0.34mg/ml;酶/抗原摩爾比=1.4:1.3.選用單克隆抗體M<,3>為包被抗體建立IgM抗體捕獲法,并對

4、其進行評價:①特異性捕獲HEV IgM抗體的證據(jù):檢測3只實驗感染非人靈長類動物系列血清,均能檢測到HEV IgM抗體陽轉(zhuǎn),抗體滴度達高峰后逐漸降低,至轉(zhuǎn)陰,而此時HEV IgG抗體仍維持在較高滴度;10份陽性標本DTT處理后檢測結(jié)果全部陰性.②敏感性和特異性:用該方法檢測37份HEV RT-nPCR陽性的肝炎病人血清,結(jié)果全部陽性;檢測采集自7個國家的血清標本,與美國CDC檢測結(jié)果比較,總檢出符合率為100％;分別檢測5份HAV陽性、

5、8份HBV陽性和12份HCV陽性血清標本,結(jié)果全部陰性.③檢測291份門診血清標本,與Genelabs公司試劑盒檢測結(jié)果比較,符合率為94.5％,但有3份標本進口試劑盒檢測陽性,該方法未檢出,13份標本該方法檢測為陽性,進口試劑盒未檢出,這13份標本進一步以HEV RT-nPCR檢測,得到2份陽性,HEV抗原中和實驗全部陽性,說明與Genelabs公司試劑盒相比,該方法檢出率更高;檢測48份血清標本與該實驗室用同樣抗原建立的ELISA一

6、步法檢測結(jié)果進行比較,檢出率相同,該方法具有陰性本底低、陽性標本OD值高的特點,總之,該檢測方法靈敏度和特異性較好.④穩(wěn)定性:本試劑在4℃至少穩(wěn)定6個月,穩(wěn)定性較好.⑤重復性:批內(nèi)變異系數(shù)和批間變異系數(shù)均小于10％,重復性較好.[結(jié)論]1.所制備的單克隆抗體M3能特異性地捕獲人血清中的IgM類抗體.2.用高純度和高效價的多基因型HEV混合重組抗原進行辣根過氧化物酶標記,質(zhì)量符合要求,能夠用于建立HEV IgM抗體捕獲法.3.所建立的HE