不同強(qiáng)度和時(shí)程應(yīng)激對(duì)不同月齡大鼠海馬HSP70mRNA表達(dá)及習(xí)慣化表達(dá)的研究.pdf

1、熱休克反應(yīng)是機(jī)體在高溫、缺血、缺氧、感染、休克等各種不利因素作用下發(fā)生的細(xì)胞程序化反應(yīng)，可以起到保護(hù)休克結(jié)局的作用。熱休克蛋白家族(HSPs)是此過(guò)程中明顯表達(dá)的一組序列高度保守的伴隨細(xì)胞蛋白，參與細(xì)胞的應(yīng)激保護(hù)機(jī)制，增強(qiáng)機(jī)體的抗感染、耐高溫、抗休克能力。應(yīng)激引起多種組織器官的HSP家族表達(dá)水平增加，其中HSP70是最重要、表達(dá)范圍最廣泛、表達(dá)量最多的一組。 在正常組織細(xì)胞中，HSP70可存在于細(xì)胞漿、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔及線(xiàn)粒體等部位，應(yīng)

2、激時(shí)，HSP70進(jìn)入細(xì)胞核并包圍核仁，恢復(fù)后進(jìn)入胞漿[2]。HSP70具有多種生物學(xué)功能：參與免疫調(diào)節(jié)，抑制高溫應(yīng)激時(shí)活性氧(ROS)及細(xì)胞因子的產(chǎn)生，從而保護(hù)細(xì)胞和組織免受炎癥損傷；分子伴侶作用[3]，參與蛋白質(zhì)的折疊、轉(zhuǎn)運(yùn)、聚集，促進(jìn)變性蛋白質(zhì)的消除，維持細(xì)胞的自穩(wěn)定。另外，HSP70還具有抗氧化、參與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)及信號(hào)傳導(dǎo)等多種功能[4、5]。 應(yīng)激反應(yīng)時(shí)，HSP70表達(dá)明顯增加，并且由于應(yīng)激源性質(zhì)及應(yīng)激持續(xù)時(shí)間的差異，其

3、表達(dá)也具有時(shí)序性與區(qū)域性。有研究表明[6、7]，大鼠外傷性腦損傷后，大腦、小腦、腦干等部位在15min內(nèi)HSP70mRAN表達(dá)迅速增加，在6h內(nèi)雖有所降低但仍保持較高水平，而高熱可以使大鼠下丘腦、內(nèi)側(cè)疆核、齒狀回細(xì)胞內(nèi)HSP70mRNA表達(dá)顯著增加，但在基底神經(jīng)節(jié)和腦干神經(jīng)元內(nèi)則幾乎無(wú)HSP70表達(dá)。同時(shí)，年齡對(duì)HSP70表達(dá)的影響已有一些文獻(xiàn)報(bào)道。在體外實(shí)驗(yàn)中，老化細(xì)胞的HSP70表達(dá)下降，Nitta[8]等證實(shí)，晚期的人類(lèi)二倍體成纖

4、維細(xì)胞、T細(xì)胞在熱休克反應(yīng)時(shí)HSP70表達(dá)比早期細(xì)胞要少，且HSP70的表達(dá)減弱發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中[9]，老年鼠的皮膚、肺及腦在熱應(yīng)激時(shí)HSP70誘導(dǎo)減弱。因此，隨著年齡的增加，細(xì)胞合成HSP70的能力降低，可能是衰老機(jī)體對(duì)應(yīng)激耐受力逐漸降低的原因之一。 生活在社會(huì)群體中的人們無(wú)論在生活還是在工作、學(xué)習(xí)過(guò)程中都要面對(duì)各種壓力，接受各種刺激，產(chǎn)生機(jī)體的應(yīng)激反應(yīng)。應(yīng)用動(dòng)物模型研究應(yīng)激作用機(jī)制、對(duì)機(jī)體產(chǎn)生的影響及其保護(hù)機(jī)制，

5、對(duì)于研究如何緩解應(yīng)激狀態(tài)，降低機(jī)體損傷等具有積極意義。 本次實(shí)驗(yàn)采用不同強(qiáng)度強(qiáng)迫游泳刺激對(duì)不同月齡大鼠建立動(dòng)物模型。青年大鼠和老年大鼠兩大組別的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物各自隨機(jī)分組后，分別應(yīng)用4℃冰水和25℃溫水實(shí)施急、慢性應(yīng)激刺激。在慢性應(yīng)激時(shí)，兩大組各隨機(jī)選取一組為應(yīng)激習(xí)慣化組，同時(shí)選取未刺激組作為對(duì)照組，分別在應(yīng)激后0mim、30min、1h、3h、6h處死動(dòng)物取海馬組織，應(yīng)用RP-PCR測(cè)定大鼠海馬HSP70mRNA的表達(dá)，從分子水平檢

6、測(cè)應(yīng)激后HSP70與基礎(chǔ)水平的差異。應(yīng)用放射免疫測(cè)定法測(cè)定外周血糖皮質(zhì)激素的含量變化，觀察應(yīng)激對(duì)動(dòng)物激素水平的的影響；用open-field法測(cè)定應(yīng)激強(qiáng)度、衰老對(duì)動(dòng)物行為改變的影響。通過(guò)上述研究，進(jìn)一步探討：(1)急、慢性應(yīng)激時(shí)HSP70表達(dá)的時(shí)序性及其在機(jī)體的保護(hù)機(jī)制中所起作用的異同，(2)在低強(qiáng)度慢性應(yīng)激作用下海馬HSP70表達(dá)是否會(huì)出現(xiàn)習(xí)慣化(機(jī)體是否會(huì)出現(xiàn)適應(yīng)性反應(yīng))。當(dāng)動(dòng)物出現(xiàn)習(xí)慣化時(shí)改變應(yīng)激源強(qiáng)度，對(duì)機(jī)體反應(yīng)的影響。(3)觀

7、察不同年齡動(dòng)物應(yīng)激反應(yīng)時(shí)HSP70mRNA表達(dá)量的差異，探討衰老對(duì)海馬HSP70表達(dá)及機(jī)體應(yīng)激反應(yīng)的強(qiáng)度及適應(yīng)能力的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下： 1.慢性強(qiáng)迫游泳應(yīng)激對(duì)不同月齡大鼠海馬HSP70mRNA表達(dá)的影響：大鼠海馬HSP70mRNA表達(dá)在刺激后表達(dá)增加，但隨時(shí)間的延長(zhǎng)表達(dá)逐漸減少。25℃溫水強(qiáng)迫游泳8天后，青年組和老年組大鼠在不同時(shí)段海馬HSP70mRNA表達(dá)與對(duì)照組存在顯著差異(P＜0.01)，不同年齡組大鼠HSP70mRNA

8、表達(dá)在不同時(shí)段存在顯著差異(P＜0.01)。 2.不同應(yīng)激強(qiáng)度和時(shí)程對(duì)大鼠海馬HSP70mRNA表達(dá)的影響：采用4℃冰水(1天)和25℃溫水(8天)對(duì)大鼠實(shí)施急、慢性刺激。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組大鼠在不同時(shí)段海馬HSP70mRNA表達(dá)存在顯著差異(P＜0.01)，急性應(yīng)激組大鼠HSP70mRNA表達(dá)在各個(gè)時(shí)點(diǎn)明顯高于慢性應(yīng)激應(yīng)激組大鼠(P＜0.01)，隨時(shí)間延長(zhǎng)HSP70mRNA表達(dá)逐漸減少。 3.慢性應(yīng)激習(xí)慣化及去習(xí)慣化后大鼠

9、海馬HSP70mRNA表達(dá)的改變：采用25℃溫水強(qiáng)迫游泳8天建立慢性應(yīng)激習(xí)慣化組；25℃溫水強(qiáng)迫游泳7天后給予4℃冰水強(qiáng)迫游泳建立去習(xí)慣化組，兩組大鼠實(shí)驗(yàn)指標(biāo)與對(duì)照組比較在各個(gè)時(shí)點(diǎn)存在顯著性差異，兩實(shí)驗(yàn)組大鼠海馬HSP70mRNA表達(dá)在應(yīng)激后不同時(shí)段存在顯著差異(P＜0.01)，隨時(shí)間延長(zhǎng)，HSP70mRNA表達(dá)量減少。 4.不同應(yīng)激時(shí)程對(duì)不同月齡大鼠血清皮質(zhì)醇含量的影響：不同應(yīng)激強(qiáng)度對(duì)相同月齡大鼠血清皮質(zhì)醇含量有影響，但差異無(wú)

10、顯著性；相同應(yīng)激方式對(duì)不同月齡大鼠血清皮質(zhì)醇含量在不同時(shí)段影響有顯著性差異。不同月齡大鼠應(yīng)激后在30分鐘左右皮質(zhì)醇含量增高較為明顯，隨時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸降低。 5.慢性應(yīng)激習(xí)慣化及去習(xí)慣化后不同月齡大鼠行為的變化：通過(guò)記錄不同月齡大鼠在曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中的跨格數(shù)、直立次數(shù)、中央格停留時(shí)間、修飾次數(shù)和糞便粒數(shù)來(lái)觀察大鼠行為學(xué)方面的改變。結(jié)果顯示：不同月齡大鼠慢性應(yīng)激習(xí)慣化組與去習(xí)慣化組在直立次數(shù)、跨格數(shù)和修飾次數(shù)三個(gè)行為學(xué)指標(biāo)與對(duì)照組比較有顯

11、著性差異(P＜0.01)，中央格停留時(shí)間和糞便粒數(shù)變化差異無(wú)顯著性。 結(jié)論： 1.慢性強(qiáng)迫游泳應(yīng)激對(duì)不同月齡大鼠海馬HSP70mRNA表達(dá)的影響：青年組和老年組大鼠強(qiáng)迫游泳應(yīng)激8天后，海馬HSP70mRNA表達(dá)與對(duì)照組相比明顯升高。青年組HSP70mRNA表達(dá)在應(yīng)激后60分鐘左右達(dá)高峰，以后逐漸降低；老年組在30分鐘左右達(dá)高峰，以后逐漸降低，6小時(shí)后接近正常水平。提示機(jī)體受到慢性應(yīng)激刺激后出現(xiàn)保護(hù)性反應(yīng)，引起HSP70m

12、RNA轉(zhuǎn)錄增加，但隨時(shí)間延長(zhǎng)HSP70mRNA生成逐漸減少。青年組在應(yīng)激后各個(gè)時(shí)段HSP7mRNAO表達(dá)均明顯高于老年組，提示衰老是影響機(jī)體應(yīng)激反應(yīng)能力的因素之一。 2.不同應(yīng)激強(qiáng)度與時(shí)程對(duì)不同月齡大鼠海馬HSP70mRNA表達(dá)的影響：急、慢性應(yīng)激都導(dǎo)致不同月齡大鼠海馬HSP70mRNA表達(dá)增加，但急性應(yīng)激組大鼠HSP70mRNA轉(zhuǎn)錄在多個(gè)時(shí)點(diǎn)均顯著高于慢性應(yīng)激組大鼠，提示應(yīng)激時(shí)程的改變可以引起HSP70mRNA表達(dá)量發(fā)生變化，

13、且隨應(yīng)激源強(qiáng)度的增強(qiáng)，表達(dá)量增加。 3.應(yīng)激習(xí)慣化及去習(xí)慣化后大鼠海馬HSP70mRNA表達(dá)的改變：重復(fù)強(qiáng)迫溫水游泳應(yīng)激引起大鼠HSP70mRNA表達(dá)習(xí)慣化，再給予4℃冰水強(qiáng)迫游泳刺激，可引起HSP70mRNA在各個(gè)時(shí)點(diǎn)表達(dá)顯著增強(qiáng)，提示重復(fù)低強(qiáng)度應(yīng)激能引起機(jī)體的習(xí)慣化反應(yīng)，即對(duì)應(yīng)激源的適應(yīng)性反應(yīng)，此后改變應(yīng)激源的強(qiáng)度則可以逆轉(zhuǎn)低強(qiáng)度應(yīng)激引起的習(xí)慣化效應(yīng)，伎機(jī)體產(chǎn)生去習(xí)慣化反應(yīng)，當(dāng)機(jī)體在重復(fù)低強(qiáng)度應(yīng)激的基礎(chǔ)上再次受到強(qiáng)烈刺激，產(chǎn)

14、生強(qiáng)烈反應(yīng)，但反應(yīng)水平低于急性應(yīng)激反應(yīng)水平。 4.大鼠血清皮質(zhì)醇含量改變：急、慢性應(yīng)激都引起大鼠血清皮質(zhì)醇含量增加，但應(yīng)激時(shí)程的改變對(duì)相同月齡大鼠血清皮質(zhì)醇含量改變的影響差異無(wú)顯著性；相同應(yīng)激時(shí)程則引起不同月齡大鼠血清皮質(zhì)醇含量明顯增加，青年組大鼠在多個(gè)時(shí)點(diǎn)皮質(zhì)醇含量明顯高于老年組，差異有顯著性。皮質(zhì)醇作為應(yīng)激激素，其含量升高表明機(jī)體處于應(yīng)激狀態(tài)，且隨應(yīng)激水平的升高而發(fā)生改變。 5.大鼠行為學(xué)方面的改變：慢性應(yīng)激及應(yīng)激習(xí)