心脈隆注射液對(duì)新生SD大鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化的影響.pdf

1、傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為，成人神經(jīng)細(xì)胞損傷后無法再生，功能無法重建，以致中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷及變性疾病患者的神經(jīng)功能很難恢復(fù)。近年研究發(fā)現(xiàn)，在胚胎期和成年期哺乳動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)中存在具有自我增殖、自我更新和多向分化潛能的神經(jīng)干細(xì)胞(neuralstemcells，NSCs)，神經(jīng)干細(xì)胞由胚胎早期的神經(jīng)上皮細(xì)胞產(chǎn)生，能夠分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞，神經(jīng)干細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)不能再生的傳統(tǒng)理論提出了挑戰(zhàn)，為研究神經(jīng)細(xì)胞的再生和功能重建帶來了新

2、前景。然而，自然情況下，神經(jīng)干細(xì)胞大部分分化為膠質(zhì)細(xì)胞，僅少量分化為神經(jīng)元，目前尚無法有效控制神經(jīng)干細(xì)胞定向分化為特定的神經(jīng)細(xì)胞，因此，如何調(diào)控NSCs定向分化為功能性神經(jīng)元成為神經(jīng)科學(xué)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)和難點(diǎn)之一。心脈隆注射液(xinmailonginjection，XML)是從昆蟲美洲大蠊體內(nèi)提取的核苷類化合物，有實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，美洲大蠊提取物具有抗腫瘤、抗菌、抗病毒、抗炎、促血管增生和組織修復(fù)、清除自由基等作用。本實(shí)驗(yàn)旨在觀心脈隆注

3、射液對(duì)體外培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化作用的影響，探討其是否可以誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元分化。
　　 目的:
　　 建立新生SD大鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞體外分離培養(yǎng)方法;并鑒定神經(jīng)干細(xì)胞;探討心脈隆注射液對(duì)新生SD大鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化作用的影響。
　　 方法:
　　 1、從新生24h內(nèi)SD大鼠腦組織中分離海馬，采用無血清懸浮培養(yǎng)，并進(jìn)行傳代培養(yǎng)，相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，將第3代以免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)Nestin、5

4、-溴脫氧尿嘧啶核苷（5-Bromo-2-deoxyUridine，Brdu）表達(dá)和神經(jīng)干細(xì)胞分化后微管相關(guān)蛋白2(microtubule-associatedprotein2，MAP-2)、膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glialfibrillaryacidicprotein，GFAP）的表達(dá)。
　　 2、將終濃度為0.5％、1％、2％的心脈隆注射液加入到第3代神經(jīng)干細(xì)胞單細(xì)胞懸液中有血清貼壁培養(yǎng)并分實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。每3d更換分化培養(yǎng)基1次

5、，干預(yù)5d后倒置顯微鏡下觀察神經(jīng)干細(xì)胞的形態(tài)。
　　 3、采用免疫熒光化學(xué)染色，觀察分化后細(xì)胞MAP-2、GFAP表達(dá)情況，應(yīng)用ImageProplus6.0軟件計(jì)數(shù)MAP-2陽性細(xì)胞數(shù)，并計(jì)算分化率。
　　 4、四甲基偶氮唑鹽比色法（MTT法）觀察心脈隆注射液對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞增殖能力的影響。
　　 5、將終濃度為2％的心脈隆注射液加入到第3代神經(jīng)干細(xì)胞單細(xì)胞懸液中有血清培養(yǎng)，并設(shè)立對(duì)照組，5～7d后用RTQ-PCR

6、法檢測(cè)神經(jīng)元特異性烯醇化酶表達(dá)量。
　　 6、應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)心脈隆注射液對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞凋亡的影響。
　　 結(jié)果:
　　 1、從新生SD大鼠海馬中分離培養(yǎng)的細(xì)胞具有增殖、自我更新和分化的能力，神經(jīng)球免疫化學(xué)染色Nestin、BrdU陽性，由其分化的細(xì)胞一部分神經(jīng)元特異性標(biāo)記物MAP-2陽性、一部分星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物GFAP陽性。
　　 2、倒置顯微鏡下觀察，與對(duì)照組相比，心脈隆注射液干預(yù)組分化出更多的神經(jīng)

7、元細(xì)胞，且免疫熒光化學(xué)染色后實(shí)驗(yàn)組明顯高于對(duì)照組，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05）。
　　 3、四甲基偶氮唑鹽比色法結(jié)果顯示，細(xì)胞培養(yǎng)5d后，XML干預(yù)組OD值高于空白對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.05）。
　　 4、熒光實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組神經(jīng)元特異性烯醇化酶表達(dá)量大于對(duì)照組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 5、流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果顯示，各實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組之間凋亡率無明顯差異。
　　 結(jié)論: