磁共振灌注成像監(jiān)測組織工程骨血管化的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、1制備骨組織工程實(shí)驗(yàn)用恒河猴脛骨骨缺損模型，為下一步研究提供一種標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型； 2探討磁共振灌注成像監(jiān)測組織工程骨血管化的可行性及其方法學(xué)，為組織工程骨的科學(xué)研究和臨床應(yīng)用提供一種無創(chuàng)、可靠的監(jiān)測手段； 3對(duì)比磁共振灌注成像、X-線、放射性核素骨顯像監(jiān)測組織工程骨血管化的特點(diǎn)，探討磁共振灌注成像方法的優(yōu)缺點(diǎn)； 4研究磁共振灌注成像結(jié)果與組織學(xué)檢查之間的關(guān)系，檢驗(yàn)磁共振灌注成像方法監(jiān)測組織工程骨血管化是否確實(shí)

2、可靠。 方法 1成年雄性恒河猴12只，根據(jù)鋼板固定的位置不同隨機(jī)分為內(nèi)側(cè)組和外側(cè)組，每組6只。均于左脛骨中段制作20mm骨缺損模型，采用7孔AO鈦合金鋼板固定。術(shù)后進(jìn)行大體觀察；并在6、12、24周行X-線攝片、ECT、組織學(xué)檢查；術(shù)后24周處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，取實(shí)驗(yàn)側(cè)脛腓骨進(jìn)行生物力學(xué)測試，并測量對(duì)側(cè)脛骨長度、中段直徑。 2另取17只成年恒河猴，其中13只恒河猴的25個(gè)下肢隨機(jī)分為五組，每組5個(gè)，剩余4只恒河猴備用(

3、補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)用)，分組如下：A組：β-磷酸三鈣(β-TCP)+骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)+血管束；B組：β-TCP+血管束；C組：β-TCP+BMSCs；D組：β-TCP；E組：空白對(duì)照。從髂后上棘抽取恒河猴骨髓，用全骨髓培養(yǎng)法進(jìn)行體外培養(yǎng)獲得骨髓基質(zhì)干細(xì)胞，條件培養(yǎng)基培養(yǎng)傳代細(xì)胞，取第三代細(xì)胞與材料復(fù)合。血管束采用恒河猴脛骨內(nèi)側(cè)隱動(dòng)靜脈分支。術(shù)后4、8、12周使用德國SIEMENS公司生產(chǎn)1.5T超導(dǎo)型MR成像系統(tǒng)掃描檢查，采用自旋回波

4、序列(EPI-SE)，TR9ms，TE4ms，激發(fā)角40°，矩陣256×128，掃描周期2s。使用自動(dòng)高壓注射器自恒河猴前臂頭靜脈注射對(duì)比劑釓噴替酸葡甲胺(Gd-DTPA，0.2mmol/kg，3ml/s)，在開始團(tuán)注對(duì)比劑的同時(shí)啟動(dòng)灌注掃描程序，在80s內(nèi)成像40幅，得到一動(dòng)態(tài)圖像系列。將組織工程骨中部橫斷面作為感興趣區(qū)(ROI)，由計(jì)算機(jī)自動(dòng)生成信號(hào)強(qiáng)度-時(shí)間(SI-T)曲線和SI-T表。依據(jù)SI-T表中的數(shù)據(jù)計(jì)算ROISI-T曲線

5、的基線、最大線性斜率(SSmax)和最大信號(hào)強(qiáng)度上升值(MSI)。 3對(duì)第二部分實(shí)驗(yàn)動(dòng)物行X線檢查：術(shù)后4w、8w、12w拍攝恒河猴雙脛骨正側(cè)位X線片。拍攝條件：電壓42KV，電流100mA，曝光時(shí)間0.12s，球管距離臺(tái)面80cm。在PACs(FCR5000)影像工作站獲得電子圖像，將所得照片統(tǒng)一調(diào)節(jié)為窗位：1400，窗寬：1660。直接在工作站上測得各組骨缺損區(qū)內(nèi)的透光度。ECT檢查：術(shù)后4w、8w、12w行放射性同位素檢查

6、。GE公司HawkeyeSPECT-VG/8S型掃描儀；顯像劑：99mTc-MDP，劑量：370MBq(10mCi)；采集條件：探頭為低能高分辨準(zhǔn)直器，能峰140kev，窗寬20％，矩陣512×512，放大1.5。恒河猴上肢前臂淺靜脈注藥4h后，采集一幅靜態(tài)顯像即延遲相，以骨缺損處1×2cm2大小的矩形為感興趣區(qū)(ROI)，同位素計(jì)數(shù)，為排除每只恒河猴注射劑量的差異，均以左側(cè)股骨中段同樣大小ROI的同位素計(jì)數(shù)為標(biāo)準(zhǔn)，將雙側(cè)脛骨骨缺損部位

7、感興趣區(qū)的同位素計(jì)數(shù)分別與之相比，求得ROI的同位素計(jì)數(shù)比值。 4第二部分實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，術(shù)后4、8周，各組均取一個(gè)標(biāo)本做組織學(xué)檢查(為保證每組樣本量不少于5個(gè)，將剩余的4只恒河猴補(bǔ)充實(shí)驗(yàn))。術(shù)后12周各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行墨汁灌注，在股動(dòng)脈內(nèi)插管，肝素鹽水沖洗后，灌入配制好的復(fù)合墨汁(墨汁配制比例，墨汁：甲醛：生理鹽水=2∶1∶7)，取出實(shí)驗(yàn)動(dòng)物雙側(cè)脛骨，將生物材料連同兩端骨質(zhì)一同完整取下，放入10％甲醛溶液中固定1周，脫鈣、脫水，二甲苯

8、透明處理，石蠟包埋后在材料的橫斷面進(jìn)行切片，切片厚度4μm，HE染色。采用ImageProPlus圖形分析軟件進(jìn)行血管面積圖像分析。 結(jié)果 1術(shù)后第4w，外側(cè)組1例鋼板彎曲，小腿向前外側(cè)成角畸形；X線檢查：術(shù)后6w、12w、24w所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物骨缺損區(qū)均無成骨表現(xiàn)，術(shù)后24w的X線片可見骨缺損兩端硬化萎縮呈骨不連表現(xiàn)。兩組術(shù)后6w、12w、24w的透光度比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；ECT檢查：術(shù)后6w、12w、24w感興趣區(qū)(ROI

9、)同位素計(jì)數(shù)之間無顯著性性差異(P＞0.05)，攝取比值(T/NT)也無顯著性差異(P＞0.05)；組織學(xué)檢查：術(shù)后6w、12w、24w骨缺損處由大量結(jié)締組織充填。生物力學(xué)前后位三點(diǎn)彎曲應(yīng)力測試，內(nèi)側(cè)組727.23±42.74；外側(cè)組533.06±88.04。兩者相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.014)；恒河猴脛骨數(shù)據(jù)：脛骨長度139.85±10.50mm；中段前后徑10.56±0.96mm；中段左右徑9.60±0.89mm。 2信號(hào)

10、強(qiáng)度-時(shí)間(SI-T)曲線最大線性斜率(SSmax)的改變：A、B兩組術(shù)后8w與4w相比均有較大幅度的提高(A組：P=0.001，B組：P=0.033)，術(shù)后8w兩組間SSmax相比，A組高于B組(P=0.010)。C、D兩組SI-T曲線的SSmax術(shù)后8w與4w相比均有提高(C組：P=0.001，D組：P=0.017)，術(shù)后12w與8w相比亦有提高(C組：P=0.042，D組：P=0.036)。空白對(duì)照的E組，術(shù)后12w與4wSSma

11、x相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.028)。信號(hào)強(qiáng)度-時(shí)間(SI-T)曲線的基線(Baseline)的改變：A組術(shù)后8w與4w相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.004)。最大信號(hào)強(qiáng)度上升值(MSI)的改變：術(shù)后8w，各組間除A和B兩組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.246)，其他各組間對(duì)比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 3X-線檢查，A組透光度測量：術(shù)后8w、12w下降值均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P=0.001)。B、C兩組12w與8w相比下降值有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(B組：P=0

12、.002，C組：P=0.021)。術(shù)后12wA組5個(gè)樣本的透光度與磁共振灌注成像檢查的SSmax呈負(fù)相關(guān)(r=-0.892，P=0.042)。ECT：術(shù)后8w與4w相比A、C兩組ROI同位素計(jì)數(shù)比值增高有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(A組：P=0.015，C組：P=0.042)。術(shù)后8w組間對(duì)比：五個(gè)組同位素計(jì)數(shù)比值相互之間均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。術(shù)后8wA組5個(gè)樣本的同位素計(jì)數(shù)比值與磁共振灌注成像檢查的SSmax呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.899，P=0.038)。

13、 4組織學(xué)檢查：術(shù)后4w，A組材料斷面中央及骨端有部分骨組織形成，臨近的材料內(nèi)也有新骨的形成；B、C兩組僅有少量骨組織可見；D組無骨組織形成。術(shù)后8w，A組可見較多骨組織形成，材料崩解；B、C兩組有部分骨組織生長；D組少量骨組織形成。E組骨缺損區(qū)為纖維結(jié)締組織充填。術(shù)后12w，A組小血管形成最多，血管周圍可見形成的大量骨組織，材料消失；B、C兩組有大量骨組織生長；D組有部分骨組織形成。E組骨缺損無任何骨組織發(fā)現(xiàn)，仍為纖維結(jié)締組織

14、充填。血管面積圖像分析：A組12w血管面積值與其磁共振灌注曲線最大線性斜率呈正相關(guān)(r=0.894，P=0.041)。 結(jié)論 1恒河猴脛骨中段20mm骨缺損模型不能自主修復(fù)成骨，符合骨組織工程動(dòng)物模型的要求；鋼板脛骨內(nèi)側(cè)固定較外側(cè)固定更穩(wěn)定。 2信號(hào)強(qiáng)度-時(shí)間的基線和最大線性斜率是兩個(gè)重要觀察指標(biāo)，能較好描述組織工程骨血管化程度。 3磁共振灌注成像具有：①成像參數(shù)多；②全程監(jiān)測；③靈敏度高④可定量分析；⑤