PR(+)-PR(-)乳腺癌差異表達MicroRNAs潛在作用通路的生物信息學分析及初步實驗驗證.pdf

1、研究背景：
　　 乳腺癌是嚴重危害女性健康的主要惡性腫瘤之一，近年來發(fā)病率有增高趨勢。中國乳腺癌發(fā)病率較低，但卻以年均3-4％的速度上升，遠高于全球年均0.5％的上升速度。事實上，乳腺癌是一類分子水平上高度異質性的疾病，根據不同的分子特征（ER、PR、HER-2狀態(tài)等）可將乳腺癌分成大致由4至5個亞群，即Luminal亞型(ER/PR+)、HER-2+(ER-,PR-,HER-2+)、Basal-like(ER-,PR-,HER

2、-2-)和Normal-like等，而ER/PR+又分成LuminalA(HER-2-)和LuminalB(HER-2+)。Luminal、HER-2+和Basal-like分別占65％～70％、10％和10％～15％。它們在臨床治療反應和生存方面截然不同。尤其是內分泌治療，是乳腺癌輔助治療的重要組成部分，與乳腺癌細胞的激素受體狀態(tài)密切相關，ER與PR均陽性者有效率為60％～70％，ER或PR陽性有效率為30％～40％，兩者均陰性有效率

3、小于10％。因此內分泌治療在乳腺癌治療中的地位越來越受到人們的重視。其中PR是決定乳腺癌分子分型、預測預后和指導內分泌治療的重要分子標志。然而，不同患者產生不同分子與病理類型乳腺癌的機理目前尚未明確，深入探討乳腺癌不同分子分型可能存在的分子機制，對于臨床上乳腺癌早期判斷、及時診治、判斷內分泌治療的療效具有重要意義。
　　 成熟microRNAs(miRNAs)是一類長約22nt的內源性的非編碼的單鏈微小RNA分子，能夠特異靶向信

4、使RNA(mRNA)并通過對mRNA剪切或轉錄后抑制的機制發(fā)揮重要的調節(jié)功能。通過與靶基因3'UTR完全或者不完全的匹配，miRNA可以降解靶基因的mRNA或者抑制靶基因mRNA的翻譯.眾多研究表明，當改變miRNA的表達水平時，它的很多靶基因的表達也會呈現出明顯變化。目前普遍認為microRNAs參與的基因調控是遺傳程序中最基本的一步，調控著細胞分化、生長、凋亡、代謝等功能，它的異常表達與腫瘤相關的信號轉導通路有密切聯系。MicroR

5、NA表達譜分析顯示，在乳腺癌組織和正常組織之間，以及不同類型乳腺癌組織之間都存在特異性的microRNA標記。近年的研究表明，在乳腺癌中不同狀態(tài)孕激素受體(PR)之間亦存在差異表達microRNAs，提示microRNAs可能參與PR(+)/PR(-)形成的調控過程。
　　 二、研究目的
　　 1.了解目前乳腺癌內分泌治療相關基因的研究現狀，以明確進一步研究與內分泌密切相關的分子分型的必要性。
　　 2.對PR(

6、-)/PR(+)乳腺癌microRNAs差異表達譜進行生物信息學分析，探討microRNAs在PR表達狀態(tài)中可能參與的調控機制，為深入研究乳腺癌不同分子亞型的分化提供新思路。
　　 3.根據生物信息學預測所得結果，構建miRNA與靶基因的熒光素酶報告基因系統(tǒng)進行初步的實驗驗證，為進一步研究乳腺癌的分子分型提供實驗依據。
　　 三、實驗方法
　　 第一部分
　　 1.1文獻檢索
　　 選取Embas

7、e數據庫、Medline/Pubmed數據庫為檢索數據庫。Embase數據庫進行Emtree擴展檢索，輔以自由詞的題目及摘要字段的檢索;Pubmed/Medline數據庫進行MeSH檢索，輔以自由詞的題目及摘要字段的檢索。
　　 1.2文獻計量分析
　　 采用Endnote X3軟件對所檢索文獻管理，在此軟件平臺上完成文獻納入排除工作。用文獻列表轉換器將Endnote X3中的標注信息導出，對最終符合納入標準的每篇文獻分

8、別進行出版年、國家、期刊、研究機構、作者進行統(tǒng)計。
　　 第二部分
　　 2.1數據挖掘:在數據庫中，以“microRNAs”和“breast cancer”為任意詞進行檢索，納入標準為“人類”及“臨床樣本”。對檢索結果進行人工分析，篩選出相關文獻及差異表達miRNAs集。
　　 2.2靶基因的預測及去重:利用Targetscan軟件對各篇文獻中挖掘所得的差異表達miRNAs集及各個miRNAs集的合集進行預測，

9、得到多個靶基因集及靶基因合集。再利用DAVID數據庫中的“Gene ID Conversion”功能模塊對靶基因集去除重復基因。
　　 2.3靶基因集的兩步富集:(Step1)以整個人類基因組為背景對照，利用DAVID數據庫中“Functional Annotation Chart”功能模塊下的“tissue_expression”工具對靶基因集中乳腺組織特異性表達的基因進行組織富集。(Step2)同樣以人類基因組為背景對照，再

10、利用“Functional Annotation Chart”功能模塊下的基因本體論(GeneOntology，GO)生物學過程(biological processes，BP)分類對經過組織特異性表達富集后的靶基因集進行GO BP分類富集，統(tǒng)計學顯著性臨界值取P≤0.05。
　　 2.4靶基因集的功能及通路分析:利用DAVID數據庫中“Functional AnnotationChart”功能模塊下的“GOTERM_ BP_

11、FA”和“GOTERM_MF_FAT”功能對經過兩步富集分析后的靶基因集分別進行GO生物學過程(BP)、GO分子功能(molecularfunction，MF)分析，再利用“KEGG_Pathways”和“BIOCARTA”分析功能進行信號和通路分析。統(tǒng)計學顯著性臨界值取P≤0.05。
　　 第三部分
　　 3.1靶向CARM1基因的miRNAs預測與篩選:根據第二部分生物信息學的結果，我們選擇CARM1為研究對象，通過

12、Pictar、Miranda、TargetScan初步預測作用于CARM1的所有microRNA，然后再對比第一部分中PR(+)/PR（-）乳腺癌差異表達microRNA表達譜中的miRNA，判斷預測可能作用于CARM1的microRNA，再以篩選出的miRNA與CARM1為研究對象進行下一步實驗驗證。
　　 3.2攜目的基因重組質粒的構建:設計并人工合成針對microRNA的CARM1目的基因片段并定向克隆到psiCHECK-

13、2載體上，采用雙酶切凝膠電泳與基因測序法鑒定重組載體psi-CHECK-2-CARM1-9與psi-CHECK-2-CARM1-103。
　　 3.3雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)的構建:將該重組質粒瞬時轉染至Hela細胞后用雙熒光報告檢測系統(tǒng)進行熒光檢測以確定miRNA與CARM1基因的靶向關系。
　　 四、結果
　　 4.1第一部分
　　 乳腺癌內分泌治療相關基因的研究正處于一個快速發(fā)展的階段。美國是該領域相

14、關研究最為活躍的國家。關注這一主題的文獻逐漸增多，其中尤以BreastCancer Research and Treatmen與Clinical Cancer Research期刊載文量為多。
　　 4.2第二部分
　　 通過文獻挖掘找到3個差異表達microRNA數據集，生物信息學分析獲得3個相應靶基因集和1個靶基因合集。靶基因的GO分類主要涉及細胞內的信號級聯、蛋白氨基酸磷酸化、蛋白質甲基轉移酶活性及轉錄因子活性等生

15、物學過程及分子功能。通路分析發(fā)現3條KEGG信號通路和3條BIOCARTA代謝通路可能參與不同PR表達狀態(tài)的調節(jié)。其中關鍵基因CARM1引起我們的注意。
　　 4.3第三部分
　　 雙酶切凝膠電泳和基因測序鑒定重組質粒psi-CHECK-2-CARM1-9、psi-CHECK-2-CARM1-103得到的產物片段及測序結果與預期一致。分別共轉染miR-9 minics與重組質粒 psi-CHECK-2-CARM1-9、m

16、iR-103與psi-CHECK-CARM1-103至 HeLa細胞中，其中 miR-103與psi-CHECK-CARM1-103組的熒光素酶活性顯著降低(P＜0.01)，比對照組（共轉染miRNA minics與重組質粒control的HeLa細胞組）減弱了42.54％;
　　 五、結論
　　 1、乳腺癌內分泌治療的研究越來越受到重視，但有關分子機制仍有待進一步研究。
　　 2、從生物信息學的角度初步分析了m