RNA干擾沉默TREM-1對脆弱類桿菌脂多糖炎癥反應的抑制作用及其機制研究.pdf

1、第一章TREM-1在脆弱類桿菌脂多糖炎癥反應中的表達。 目的:探討在脆弱類桿菌脂多糖所誘導THP-1與HL-60細胞炎癥反應中TREM-1的表達情況及其與促炎癥因子分泌的關系。 方法:厭氧分離培養(yǎng)脆弱類桿菌臨床株，改良熱酚水法提取細菌脂多糖，以脆弱類桿菌脂多糖刺激分化后的單核細胞株THP-1和粒細胞株HL-60，半定量RT-PCR法檢測TREM-1 mRNA的表達，Western blot法檢測TREM-1蛋白的表達，并

2、用ELISA法檢測THP-1細胞上清中TNF-α、IL-1β與HL-60細胞上清中IL-6、IL-8的含量。 結果:在脆弱類桿菌脂多糖刺激下，分化后的THP-1 與 HL-60細胞中TREM-1表達水平皆明顯上調(diào)，并呈時間依賴性，分別于8h(THP-1)和 12h(HL-60)達高峰；而不同濃度的脆弱類桿菌脂多糖對TREM-1的誘導作用呈劑量依賴性，以1μg/ml 脂多糖的誘導效應最明顯；同時伴有 TNF-α、IL-1β(THP

3、-1)及IL-6、IL-8(HL-60)的大量分泌，并分別與TREM-1蛋白表達水平呈正相關(r<,s>=0.82，0.85及0.83,0.88，P<0.01)。 結論: TREM-1 表達水平在脆弱類桿菌脂多糖的誘導下呈時間一劑量依賴性增高，并可能對促炎癥因子的分泌起一定作用。構建的脆弱類桿菌脂多糖炎癥反應細胞模型為后續(xù)研究提供了實驗平臺。 第二章 TREM-1靶向性shRNA對脆弱類桿菌脂多糖炎癥反應的抑制作用。

4、 目的:研究通過RNA干擾技術使TREM-1基因沉默后對脆弱類桿菌脂多糖炎癥反應的影響。 方法:體外轉(zhuǎn)錄法合成針對TREM-1 mRNA的shRNA，電穿孔法瞬時轉(zhuǎn)染入分化后的THP-1 與HL-60細胞，繼予1μg/ml脆弱類桿菌脂多糖分別刺激8h與12h，于轉(zhuǎn)染后48h通過半定量RT-PCR法檢測 TREM-1 mRNA 的表達，Western blot法檢測 TREM-1 蛋白的表達，并用ELISA法檢測THP-1 細

5、胞上清中促炎癥因子 TNF-α、IL-1β與HL-60細胞上清中促炎癥因子IL-6、IL-8含量的變化。 結果:轉(zhuǎn)染shRNA后TREM-1 mRNA及蛋白表達均有明顯下調(diào)，其中以shRNA-2干擾效果最為明顯。同時，轉(zhuǎn)染shRNA使THP-1細胞上清中TNF-α，IL-1β的含量與HL-60細胞上清中IL-6、IL-8的含量明顯降低。而對照組無類似效果。 結論:電轉(zhuǎn)染體外轉(zhuǎn)錄合成的shRNA可選擇性抑制YREM-1表達

6、，下調(diào)脆弱類桿菌脂多糖誘導的促炎癥因子的分泌，對炎癥反應具有抑制作用。 第三章 RNA干擾沉默TREM-1對脆弱類桿菌脂多糖炎癥反應抑制作用的機制。 目的:探討RNA干擾沉默TREM-1對脆弱類桿菌脂多糖炎癥反應產(chǎn)生抑制作用的機制。 方法:電轉(zhuǎn)染TREM-1 shRNA-2或shRNA-NC入分化后的THP-1與HL-60細胞并予以脆弱類桿菌脂多糖刺激，Western blot法測定各組細胞中DAP12、NF-κ

7、B p65、IκBα蛋白表達水平，RT-PCR法檢測THP-1 細胞中 TNF-α、IL-1β mRNA及與HL-60細胞中IL-6、IL-8 mRNA表達水平。 結果:TREM-1 shRNA-2 轉(zhuǎn)染能明顯下調(diào)脆弱類桿菌脂多糖作用下THP-1 與 HL-60細胞中DAP12、NF-κB p65蛋白的表達水平和上調(diào)IκBα蛋白的表達水平，并降低 TNF-α、IL-1β及IL-6、IL-8 mRNA的表達水平，而shRNA-NC