外生菌根真菌和深色有隔內(nèi)生真菌提高油松抗松萎蔫病機(jī)制的研究.pdf

1、本論文采用高通量測(cè)序(Illumina MiSeq)技術(shù)研究了陜西柞水縣松萎蔫病(Pine WiltDisease，PWD)的發(fā)生對(duì)油松(Pinus tabulaeformis Car.)根部和根際真菌、細(xì)菌群落分布的影響，分析了PWD與土壤理化性質(zhì)的關(guān)系。篩選了抗PWD的外生菌根真菌（Ectomycorrhizal fungi，ECMF）和深色有隔內(nèi)生真菌（Dark Septate Endophytes，DSE）菌株，將ECMF和DS

2、E與松材線蟲(Bursaphelenchus xylophilus，Pinewood Nematode，PWN)接種油松幼苗，從油松幼苗抗病相關(guān)酶和抗病相關(guān)物質(zhì)以及PWN侵染對(duì)油松根部和根際微生物群落結(jié)構(gòu)變化的影響等方面初步揭示了ECMF和DSE提高油松抗PWD的機(jī)制。得出以下主要結(jié)果:
　　1.土壤理化性質(zhì)與PWD的關(guān)系
　　選擇未受PWD干擾(Undisturbed UD)、PWD中度干擾(Middle Disturbe

3、d，MD)和嚴(yán)重干擾（High Disturbed，HD）的3個(gè)油松林分，研究了PWD干擾和土層深度對(duì)土壤因子的影響。不同樣地、不同土層土壤理化性質(zhì)主成分分析表明，5～30 cm土層土壤理化性質(zhì)比30～45 cm更容易受PWD的影響。相關(guān)性分析表明，PWN侵染率與根際菌絲密度、土壤pH和土壤全磷呈顯著負(fù)相關(guān)，與土壤蔗糖酶活性呈顯著正相關(guān);松樹(shù)死亡率與根際菌絲密度和土壤pH呈顯著負(fù)相關(guān)，與土壤全氮、硝態(tài)氮和土壤有機(jī)質(zhì)含量呈顯著正相關(guān)。

4、r>　　2.PWD不同干擾樣地油松根際真菌和細(xì)菌分布
　　利用高通量測(cè)序的方法研究了PWD干擾對(duì)根際細(xì)菌和真菌群落分布的影響，結(jié)果表明油松根際主要真菌類群是擔(dān)子菌門Basidiomycete和子囊菌門Ascomycota;主要細(xì)菌類群是變形菌門Proteobacteria、酸桿菌門Acidobacteria和放線菌門Actinobacteria。隨PWD干擾程度的增加，油松根際擔(dān)子菌門真菌相對(duì)豐度由81.45％(UD)急劇減小到4

5、6.85％(MD)和44.45％(HD);而子囊菌門真菌相對(duì)豐度則由17.59％(UD)急劇增加到50.74％(MD)和52.66％(HD)。油松根際細(xì)菌各類群相對(duì)豐度在不同林分變化不太明顯。聚類分析表明PWD干擾林分與非干擾林分油松根際的細(xì)菌和真菌分類學(xué)組成相似性不同。隨PWD干擾程度加重真菌豐富度先增加后減小，多樣性逐漸增加;細(xì)菌豐富和多樣性度逐漸減小。PWD的干擾顯著(P＜0.001)降低了油松根際的菌絲密度，從1334.6 mm

6、 g-1(UD)降低到606.1 mm g-1(HD)。
　　3.油松根部ECMF和DSE等真菌侵染程度、群落結(jié)構(gòu)與PWD的關(guān)系
　　用高效液相色譜法得到PWN的侵染顯著降低了油松根部真菌的生物量，從未受侵染的0.272 mg g-1降低到0.182 mg g-1。相關(guān)性分析表明PWD與ECMF和DSE的侵染率有顯著的相關(guān)關(guān)系，ECMF侵染率隨PWD干擾程度升高顯著降低，從84.4％(UD)降低到64.1％(HD)，而DSE

7、侵染率先降低后升高，在UD、MD和HD樣地中的侵染率分別為52％、45.3％和66.7％，并且PWN的侵染降低了ECMF類群的相對(duì)豐度和群落多樣性。UD、MD和HD林分油松根部真菌的OTU數(shù)目分別為69個(gè)、70個(gè)和55個(gè)，其中UD林分特有OTU有9個(gè)，MD和HD林分分別特有8個(gè)和3個(gè)。塊菌屬Tuber、紅菇屬Russula、傘菌綱Agaricomycetes、口菇屬Tricholoma和長(zhǎng)毛盤菌屬Trichophaea真菌的相對(duì)豐度較高

8、，所占比例達(dá)80％以上，但各個(gè)類群在不同樣區(qū)的相對(duì)豐度不同。隨PWD干擾程度的增加，口菇屬真菌相對(duì)豐度增加;而傘菌綱和長(zhǎng)毛盤菌屬真菌相對(duì)豐度先增加后降低;塊菌屬和紅菇屬真菌的相對(duì)豐度則是先降低后增加。主成分分析表明不同PWD干擾程度真菌群落組成上有顯著差異。
　　4.油松抗PWD ECMF和DSE菌株篩選
　　將不同ECMF和DSE與PWN接種油松幼苗，測(cè)定油松的生長(zhǎng)特性和抗病性。結(jié)果顯示不同真菌對(duì)油松的生理指標(biāo)和根系形態(tài)的

9、影響不同。主成分分析表明，接菌處理在整體上促進(jìn)了油松苗的的生長(zhǎng)，并且ECMF和DSE這兩類群真菌之間對(duì)油松的接種效果沒(méi)有顯著差異。皮爾森相關(guān)性分析表明，PWN侵染發(fā)病率與根長(zhǎng)、根分叉數(shù)和根表面積顯著負(fù)相關(guān)與類胡蘿卜素含量顯著正相關(guān);油松組織含水量與松苗死亡率顯著負(fù)相關(guān)。模擬自然土壤條件接種ECMF和DSE于油松幼苗，篩選出能提高油松抗PWD的2株ECMF（灰鵝膏菌Amanita vaginata、粘蓋牛肝菌Suillus bovinus

10、）和2株DSE（柱孢頂囊殼菌Gaeumannomyces cylindrosporus和菊異莖點(diǎn)霉Paraphoma chrysanthemicola）菌株。接種PWN3個(gè)月后這4個(gè)ECMF和DSE菌株G.cylindrosporus、A.vaginata、S.bovinus和P.chrysanthemicola油松苗發(fā)病率分別比對(duì)照組低16.67％、26.67％、20％和6.7％，;死亡率比對(duì)照處理低20％、26.67％、23.33％

11、和10％。表明這4株ECMF和DSE能夠增強(qiáng)油松抗病性。
　　5.接種ECMF和DSE油松幼苗抗病相關(guān)酶和抗病相關(guān)物質(zhì)對(duì)PWN侵染的響應(yīng)
　　根據(jù)抗PWD篩選結(jié)果，研究了接菌油松幼苗苯丙氨酸解氨酶(PAL)、脂氧合酶(LOX)、幾丁質(zhì)酶和β-1，3-葡聚糖酶等抗病相關(guān)酶活性和木質(zhì)素、可溶性酚、丙二醛和脯氨酸抗病相關(guān)物質(zhì)含量對(duì)PWN侵染的響應(yīng)。結(jié)果表明，PWN侵染后，接種A.vaginata、G.cylindrosporus處

12、理能夠誘導(dǎo)油松迅速提高PAL酶活性，說(shuō)明在受到PWN侵染時(shí)A.vaginata、G.cylindrosporus可能激活了油松的水楊酸(SA)抗病信傳導(dǎo)途徑。接種PWN后，接種A.vaginata、S.bovinus、G.cylindrosporus和P.chrysanthemicola的油松LOX活性分別降低了19.59％、40.98％、17.08％和30.50％，說(shuō)明接菌可能降低了油松因PWN侵染而引起的過(guò)敏性反應(yīng)。PWN侵染后P.

13、chrysanthemicola和G.cylindrosporus處理油松可溶性酚含量分別增加了43.04％和6.93％，而接種A.vaginata、S.bovinus反而使油松可溶性酚含量降低了2.02％和9.73％;接種A.vaginata、S.bovinus和P.chrysanthemicola處理的油松木質(zhì)素含量分別升高37.95％、3.64％和85.97％，而接種G.cylindrosporus處理油松木質(zhì)素含量降低了4.14

14、％。在PWN侵染之后A.vaginata、S.bovinus油松游離脯氨酸含量比對(duì)照組分別高出140.79％、84.44％。但是β-1，3-葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酶活性與陽(yáng)性對(duì)照組沒(méi)有顯著的差異。說(shuō)明接種ECMF、DSE能夠通過(guò)調(diào)節(jié)抗病相關(guān)酶活性和抗病相關(guān)物質(zhì)含量，提高油松對(duì)PWD的抗性。
　　6.接種ECMF和DSE油松幼苗根部微生物對(duì)PWN侵染的響應(yīng)
　　對(duì)接種ECMF和DSE的油松苗在感染PWN后3個(gè)月、6個(gè)月和9個(gè)月的油松

15、根尖真菌群落結(jié)構(gòu)和根際微生物群落結(jié)構(gòu)，以及微生物量碳和土壤酶活進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明PWN侵染下，接種A.vaginata、S.bovinus、G.cylindrosporus和P.chrysanthemicola的油松根際微生物量碳含量比對(duì)照組分別高出38.16％、49.67％、42.11％和96.05％，說(shuō)明在PWD干擾的情況下，接種ECMF和DSE能夠減緩油松根際微生物量的降低。接菌處理和PWN的感染都會(huì)影響土壤酶活性，在受到PWN侵

16、染時(shí)，不同接菌處理對(duì)土壤酶活性的影響方式不同。利用變性梯度凝膠電泳(DGGE)的方法分析了PWN的侵染對(duì)接菌油松根際真菌和細(xì)菌的菌落結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PWN的侵染降低了油松真菌的豐富度和多樣性;接種外源菌劑，保持了油松根部真菌群落的穩(wěn)定性，使油松根部真菌群落受PWN的影響減少;不同接菌處理對(duì)油松根際細(xì)菌豐富度和多樣性的影響不同，油松接種ECMF/DSE可以增加根際有益細(xì)菌如伯克氏菌目Burkholderiales、根瘤桿菌屬Rhiz