胎兔皮膚無瘢痕愈合相關(guān)蛋白的初步篩選與分析.pdf

1、背景和目的：瘢痕愈合是創(chuàng)傷修復(fù)的主要方式，其結(jié)果是：一方面，瘢痕的形成可以覆蓋創(chuàng)面，增加創(chuàng)面強(qiáng)度；另一方面，瘢痕的增生影響表形美觀，甚至影響機(jī)體局部功能和患者的心理健康。研究發(fā)現(xiàn)許多種系動物在胚胎期能以無瘢痕愈合模式實(shí)現(xiàn)創(chuàng)口的愈合。其機(jī)制可能與基因的表達(dá)改變有關(guān)，也可能與某些蛋白的表達(dá)差異有關(guān)。 本實(shí)驗(yàn)擬建立胎兔皮膚切割傷模型，運(yùn)用雙向電泳技術(shù)分離兔皮膚組織總蛋白，經(jīng)比較和分析尋找與胎兔皮膚無瘢痕愈合相關(guān)的蛋白，了解其與無瘢痕愈

2、合的關(guān)系，為實(shí)現(xiàn)對創(chuàng)傷后瘢痕增生的干預(yù)和治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。為此，進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)。 方法：1.胎兔皮膚無瘢痕愈合模型的建立用小切口法對25只妊娠20天的胎兔背部致切割傷。其中5只胎兔待其出生；其余術(shù)后24h取創(chuàng)傷胎兔、同胞胎兔和其母兔皮膚組織，分別作為胎兔創(chuàng)傷(FT)組、胎兔對照(FC)組和成年創(chuàng)傷對照(ATC)組標(biāo)本；用哺乳動物總蛋白提取試劑盒分別提取其皮膚組織的總蛋白；用Bradford法進(jìn)行濃度測定，以確定總蛋白樣品上樣體積。

3、 2.皮膚總蛋白的雙向電泳和差異蛋白質(zhì)點(diǎn)的質(zhì)譜分析選用pH值4-7、長11cm的IPG膠條，加大電泳樣品上樣量，進(jìn)行雙向電泳，總聚焦60000Vh，用10％的聚丙烯酰胺凝膠作為分離膠，最后用硝酸銀染色電泳凝膠。三組兔皮膚總蛋白雙向電泳凝膠圖分別用ImageMaster2DPlatinu圖像分析軟件進(jìn)行分析和比對，尋找各組皮膚組織特異高表達(dá)的蛋白質(zhì)凝膠點(diǎn)。 將皮膚差異表達(dá)的蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行基質(zhì)輔助的激光解析電離/飛行時間質(zhì)譜(

4、Matrix-assistedlaserdesorption-ionizationtime-of-flightmassspectrogram，MALDI-TOF-MS)分析，得到各蛋白點(diǎn)的肽指紋圖譜，通過肽指紋圖譜檢索其相關(guān)蛋白，分析其功能。 結(jié)果：1.胎兔皮膚無瘢痕愈合模型的建立以同次妊娠的不同胎兔分別作為FT和FC，孕兔作為ATC，以保證標(biāo)本遺傳背景的一致性，在一定程度上消除了個體差異帶來的影響。術(shù)后，成年孕兔均健康存活；5

5、只待產(chǎn)孕兔均產(chǎn)下存活新生兔，新生兔無明顯瘢痕形成；其余致傷胎兔存活16只，手術(shù)成功率80％；對照胎兔均成活。提示該術(shù)式適于胎兔致傷。 本實(shí)驗(yàn)采用哺乳動物總蛋白提取試劑盒進(jìn)行總蛋白質(zhì)的提取，經(jīng)檢測各批次提取蛋白質(zhì)樣品的濃度提示：用哺乳動物總蛋白提取試劑盒提取兔皮膚組織的總蛋白，產(chǎn)品得率較高、提取效率較穩(wěn)定。 2.差異蛋白質(zhì)的質(zhì)譜分析因經(jīng)費(fèi)限制，只對FT組特異高表達(dá)的蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行MALDI-TOF-MS分析。分析結(jié)果顯示：其

6、中7個蛋白質(zhì)點(diǎn)的肽指紋圖譜與數(shù)據(jù)庫中的已知蛋白質(zhì)片段相似；10個蛋白質(zhì)點(diǎn)的檢索得分低于76或其種屬差異過大，可能為兔未知蛋白；其余3個蛋白質(zhì)點(diǎn)的蛋白含量可能太低或蛋白分離不徹底，沒有有意義的檢索結(jié)果。7個已知的蛋白質(zhì)片段再經(jīng)過同源性分析和相似性檢索，排除重復(fù)因素后確定分別是：伴侶素或線粒體蛋白P1前體、彈性蛋白(Vimentin，Vim)、微管蛋白β多肽、核不均一核糖核蛋白H(異質(zhì)性胞核核糖核蛋白H)、α-烯醇酶(α-磷酸丙酮酸水合酶)

7、。 篩選出的已知蛋白分別與基因轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞增殖、分化、發(fā)育等功能有關(guān)，與前期實(shí)驗(yàn)用改良抑制性消減雜交技術(shù)在創(chuàng)傷胎兔皮膚組織中篩選出與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞增殖、分化、發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)上調(diào)相互印證?？梢酝茰y：胎兔皮膚創(chuàng)傷后Vim、微管蛋白β多肽等促進(jìn)細(xì)胞增殖、分化和發(fā)育，并維持其正常的細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)；hnRNPH調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，促進(jìn)膠原蛋白等的合成；同時伴侶素協(xié)助多肽進(jìn)行折疊、組裝、轉(zhuǎn)運(yùn)，并能阻止錯誤的折疊和

8、促進(jìn)未折疊多肽的重折疊和正確的裝配；α-烯醇酶可能以酶的身份參與其中，調(diào)節(jié)這些過程的完成。通過這些蛋白的作用，可能使膠原纖維等成分維持正常的排列，從而抑制瘢痕的過渡增生，參與胎兔無瘢痕愈合過程。 結(jié)論：1.完善了胎兔皮膚無瘢痕愈合模型，建立了兔皮膚組織總蛋白雙向電泳技術(shù)。2.篩選出20個在FT組中特異高表達(dá)的蛋白質(zhì)點(diǎn)，13個在FC組中特異高表達(dá)的蛋白質(zhì)點(diǎn)，5個在ATC組中特異高表達(dá)的蛋白質(zhì)點(diǎn)。其中FT組中與無瘢痕愈合相關(guān)的已知蛋